论文部分内容阅读
目的：1.建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养和鉴定方法。2.判断重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-BDNF、Ad-GFP-Noggin转染对BMSCs的影响以及目的蛋白的表达情况。3.观察携带BDNF和/或Noggin的BMSCs对MCAO动物模型神经功能的修复作用。4.探讨携带BDNF和/或Noggin的BMSCs对MCAO动物模型神经功能的修复作用的机制。方法：1.经贴壁筛选法进行体外培养并纯化BMSCs,通过细胞表面标志、成骨细胞诱导和成脂细胞诱导分化鉴定获得的细胞为高纯度的BMSCs。通过MTT法判断转染对BMSCs的影响,Western blot法检测目的蛋白的表达情况。2.线栓法制作大鼠MCAO模型,TTC染色鉴定MCAO模型。实验动物随机分为正常组、假手术组(Sham组)、载体组(Vehicle组)、BMSCs组、Ad-GFP转染组、Ad-GFP-BDNF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组、Ad-GFP-BDNF和Ad-GFP-Noggin联合转染组。3.大鼠MCAO模型造模后24小时,经股静脉移植入各种基因修饰的BMSCs。mNSS评分观察动物神经功能恢复情况,荧光显微镜观察移植细胞在脑内存活、分布情况。4.免疫组化和Western blot法检测移植后缺血周边脑组织VEGF、BCL-2/Bax、GSK3β/p-GSK3β、Akt/p-Akt及TLR4/MyD88的表达情况。ELISA法检测梗塞周围脑组织MMP-9及ROS水平。结果：1.贴壁筛选法获得的细胞具有BMSCs的表型,贴壁筛选法可以获得纯度较高,活性良好的BMSCs。2.重组腺病毒转染后的BMSCs能发出绿色荧光,细胞生长状态良好。未转染组和Ad-GFP转染组少量表达BDNF,不表达Noggin。Western blot法检测显示各转染组BMSCs分别于18KD和26KD处出现一条明显的电泳条带。联合转染BMSCs Western blot检测可见18KD和26KD两条明显的电泳条带。3.线栓法制作的大鼠MCAO模型梗塞对侧肢体瘫痪,TTC染色梗塞区不着色,携带不同基因的BMSCs静脉移植1w后各组动物神经功能均有不同程度改善,其中联合转染组mNSS评分最低。4.移植后1w,梗死区域及周边缺血半暗带有移植细胞存活；移植后3w,存活的移植细胞仅存在于梗死区周边的缺血半暗带,梗死区域内未发现带有绿色荧光的移植细胞,同时对侧大脑半球纹状体及皮层下也有分布。5.各移植组梗塞周边脑组织VEGF、BCL-2、p-GSK3β和p-Akt表达均较Vehicle组升高,Ad-GFP-BDNF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组及联合转染组较BMSCs组升高明显,差异有统计学意义,P<0.01。各细胞移植组Bax、TLR4/MyD88表达较Vehicle组降低,而且Ad-GFP-BDNF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组及联合转染组较BMSCs组降低明显,差异有统计学意义,P<0.05。GSK3β和Akt各组间表达无差异。此外,各移植组MMP-9及ROS水平显著低于Vehicle组,以联合治疗组最为明显。结论：1.通过贴壁筛选法能够获得活性、纯度较高的BMSCs。2.重组腺病毒Ad-GFP-BDNF和Ad-GFP-Noggin能安全转染体外培养的大鼠BMSCs,并持续、高效表达BDNF和Noggin蛋白。Ad-GFP-BDNF和Ad-GFP-Noggin联合移植BMSCs的方法安全、有效。3.静脉移植不同基因修饰的BMSCs能够有效改善MCAO大鼠神经功能活动,移植细胞能在梗塞区及其周边脑组织存活。4.BMSCs移植能够促进MCAO大鼠梗塞周边脑组织VEGF、BCL-2、p-GSK3β和p-Akt表达,降低Bax、TLR4/MyD88表达,梗塞周边脑组织MMP-9及ROS水平降低；Ad-GFP-BDNF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组及联合转染组较BMSCs移植组更为明显。说明BMSCs移植能促进缺血脑组织血管新生,降低缺血脑组织的细胞凋亡和炎性损害,可能是通过Akt/GSK3β、TLR4/MyD88信号通路实现的；BDNF和Noggin基因修饰BMSCs移植能增强这种作用,且两种基因联合修饰BMSCs的移植方法安全、有效。