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手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）是主要在夏秋季节流行的病毒性疾病,由多种肠道病毒感染引起,曾经在全世界范围内多次暴发。目前,临床前研发的预防HFMD的主要候选疫苗为细胞基质全病毒灭活疫苗和病毒样颗粒（VLP）疫苗。然而,灭活疫苗中除EV-A71和CV-A16外,其它主要血清型病毒难于在人用疫苗基质细胞中生长。VLP具有产量大、易富集和易纯化的特点,是疫苗发展的主要趋势之一,目前在人用疫苗和兽用疫苗的研究领域都应用广泛。因此研究昆虫细胞杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,制备CV-A2 VLPs,具有重要的应用意义。肠道病毒对热极其敏感,温度升高容易诱导病毒粒子衣壳构象改变,从而影响疫苗的免疫原性和保护效力。因此,研发一种具备较好耐热特性的手足口病疫苗,将有效提升手足口疫苗的质量。本论文是由两个部分构成的,主要讨论了利用昆虫杆状病毒表达系统来构建病毒颗粒以及免疫学研究和疫苗候选株热稳定株的筛选及免疫学的初步研究。第一部分:昆虫病毒杆状系统兼有真核表达系统和原核表达系统的优势,最大的优点是,可以产生大量的重组蛋白,另外还可以同时在一个载体上表达多种重组蛋白,这使得它在未来药物研发、生物医药、疫苗生产、农业杀虫剂等方面均获得了广泛的应用。本部分主要利用杆状病毒表达系统来构建病毒样颗粒及其免疫学的研究作了详细的阐述,以期为疫苗研究提供一个新的,安全而有效的方法。本部分研究结果包括四章的内容:第一章:包括部分实验材料和实验方法中2.1、2.2和2.3的内容。第二章:应用分子生物学技术构建了重组质粒病毒pFastBacDual-P1/3CD,转化了DH10 BacTM感受态细胞,并转染昆虫细胞Sf9,成功获得重组杆状病毒rBacCVA2-P1/3CD,并传代鉴定。重组病毒感染细胞后,经纯化后,通过间接免疫荧光（IFA）、SDS-PAGE电泳、Western-Blot和透射电镜等方法鉴定了重组rCV-A2 VLPs（insect）。第三章:由于肠道病毒VLP与肠道病毒感染细胞后的空心颗粒有相似的结构,因此制备CV-A2病毒颗粒样品,与前面描述的rCV-A2 VLPs（insect）的免疫原性进行比较。本研究用CV-A2 1580毒株在10层细胞工厂感染RD细胞,收获了病毒液。经过超滤浓缩、20%蔗糖垫底和CsCl等密度梯度离心精纯等一系列操作,获得较高纯度的病毒实壳和空壳两种颗粒。通过SDS-PAGE和Western-Blot对收获的颗粒进行了验证,为动物免疫原性提供了必要的病毒颗粒抗原。第四章:通过应用纯化的rCV-A2 VLPs（insect）、CV-A2 VLP（yeast cell表达的参考品）和CV-A2-1580R4/CHN XY/2017疫苗免疫Balb/c小鼠,对其免疫原性进行初步评价。分别用rCV-A2 VLPs（insect）、CV-A2 VLPs（yeast）、CV-A21580 EP和CV-A2 1580 FP抗原对昆明鼠在第3日龄第10日龄时进行免疫,之后使用CV-A2 1388强毒株昆明鼠进行病毒攻击实验。验证了rCV-A2-VLPs（insect）和CV-A2-VLP（yeast）疫苗免疫乳鼠后的保护作用。第二部分:良好的疫苗有强的免疫力,对热稳定,易于保存。如何增强疫苗的免疫原性是目前世界范围内疫苗研究的一个新领域。本部分主要在热选择的压力下,对候选株进行了筛选,为研发热稳定性良好的疫苗候选株奠定了基础。本部分研究结果包括四章的部分内容:第一章:包括部分实验材料和实验方法中2.4、2.5和2.6的内容。第五章:在热选择压力下,挑选出CV-A2 2703-5株和CV-A2 2703-52株为热处理株。在39.5℃-65℃范围内,对CV-A2 2703-5株和CV-A2 2703-52株进行了耐热处理能力的测试,对CV-A2 2703-52的10株克隆株及CV-A2 2703-5株进行了基因组测序,并与CV-A2-1580R4/CHN XY/2017序列比对,找到了影响热稳定的突变位点。第六章:用CV-A2 2703-5和CV-A2 2703-52毒株在10层细胞工厂感染RD细胞,成功扩增了抗原并收获了病毒液。经过超滤浓缩、20%蔗糖垫底和CsCl等密度梯度离心精纯等一系列操作,获得EP和FP的两种颗粒。通过SDS-PAGE和Western-Blot对收获的颗粒进行了验证,为动物免疫提供了必要的抗原蛋白。第七章:通过应用纯化的CV-A2 2703-5和CV-A2 2703-52疫苗免疫Balb/c小鼠,对其免疫原性进行初步评价。验证了CV-A2 2703-5和CV-A2 2703-52疫苗免疫乳鼠后的保护作用。