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研究背景:胰岛素抵抗(Insulin resistance, IR)是机体对胰岛素的作用不敏感的一种病理状态,是多种疾病的“共同土壤”。胰岛素抵抗是代谢综合征最核心的发病机制,它不仅可以导致2型糖尿病,还可以导致高血压,血脂紊乱,动脉粥样硬化等多种心血管系统疾病。Apelin是血管紧张素受体样受体APJ的内源性配体,主要由脂肪细胞分泌。Apelin及其受体APJ在全身多个系统,包括心血管,下丘脑,胃肠道,皮肤,肌肉,乳腺和胎盘等,发挥着多种不同的生物学效应。研究发现,在新诊断的2型糖尿病病人中,apelin的水平是上升的,但是,在进展期的2型糖尿病病人中,apelin的水平却是降低的;另外,小鼠腹腔注射apelin后,在血糖下降的同时,血浆胰岛素的水平也出现了下降,虽然其中的机制还未完全阐明,但是,这都提示我们,apelin和胰岛素抵抗以及机体糖代谢密切相关。近期研究证实,在分离的胰岛素抵抗骨骼肌细胞中,apelin能增加葡萄糖摄取。但是,apelin作为脂肪因子,其对脂肪细胞,特别是胰岛素抵抗的脂肪细胞的有何作用,目前尚无相关文献报道。研究目的:1、Apelin对于胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的作用。2、Apelin对于胰岛素敏感性的作用,以及对于胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖摄取的作用。3、Apelin能否改善胰岛素抵抗时低度炎症状态。4、Apelin增加葡萄糖摄取,改善胰岛素抵抗的可能机制。研究方法:1、诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞,并通过油红O染色鉴定。2、用TNF-α建立胰岛素抵抗脂肪细胞模型,并通过葡萄糖摄取实验鉴定。3、通过葡萄糖摄取实验观察apelin对IR脂肪细胞糖摄取的作用,研究apelin是否能直接增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取,是否能通过增加胰岛素敏感性,间接增加葡萄糖摄取。4、用过RT-PCR检测相关炎症因子mRNA表达,通过western blotting分析相关信号通路蛋白表达,明确apelin作用于胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞可能的机理。5、通过免疫细胞化学方法观察葡萄糖转运体4(GLUT4)膜转位,通过western blotting检测GLUT4膜蛋白表达,明确GLUT4在apelin作用于胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中的作用。实验结果:1、3T3-L1前脂肪细胞接触抑制后,通过地塞米松,异丁基甲基黄嘌呤,胰岛素混合诱导剂诱导8-12天, 3T3-L1前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞。油红O染色后证实85%以上3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。2、在成熟的脂肪细胞中,10ng/ml TNF-α作用24h后,通过葡萄糖摄取实验证实:TNF-α作用组脂肪细胞对胰岛素刺激的葡萄糖摄取降低47%(P<0.05),细胞产生胰岛素抵抗。3、通过不同剂量apelin(10nM,102nM,103nM,104nM)apelin作用于胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞60分钟,及103nM apelin作用于胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞15分钟,30分钟,60分钟,120分钟,240分钟,葡萄糖摄取实验证实:apelin呈时间及浓度依赖型增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取(P<0.05 102nM apelin versus control; P<0.01 103nM apelin versus control),(P<0.01 60min versus control, P<0.05 120min versus control),(P<0.05 103nM apelin versus 102nM apelin)。4、通过葡萄糖摄取实验证实:102nM及103nM apelin预处理60分钟后,胰岛素刺激的葡萄糖摄取显著增加,103nM apelin对葡萄糖摄取具有更显著的效应。Apelin能增强胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对胰岛素的敏感性(P<0.05 102nM apelin versus insulin, P<0.01 103nM apelin versus insulin, P<0.05 103nM apelin versus 102nM apelin)。5、在100nM PI3K/Akt的特异性抑制剂渥曼青霉素作用30分钟后,apelin增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的作用显著降低(P<0.05 versus 100 nM wort, P<0.01 versus 100 nM wort)。同时,通过Western blotting实验证实100nM渥曼青霉素作用30分钟后,磷酸化Akt的水平降低。证实apelin增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取是通过PI3K/Akt通路。6、通过细胞爬片后经免疫细胞化学证实:apelin增加葡萄糖摄取是通过促进GLUT4从胞浆向胞膜转位实现的。同时,Western blotting实验检测膜蛋白GLUT4也证实,apelin能增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的GLUT4膜转位。7、提取细胞mRNA,经RT-PCR实验证实apelin能增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞抗炎因子adiponectin mRNA表达,降低炎症因子IL-6 mRNA表达(P<0.01 versus untreated)。Apelin能调节胰岛素抵抗细胞的炎症反应。结论:1、Apelin呈时间及浓度依赖型增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取,增强胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对胰岛素的敏感性。2、Apelin增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取是通过PI3K/Akt通路,增加pAkt的磷酸化及增加GLUT4从胞浆向胞膜转位而实现的。3、Apelin能增加抗炎因子adiponectin mRNA表达,降低炎症因子IL-6 mRNA表达,从而改善胰岛素抵抗时轻度炎症的状态。