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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见于中老年人的黑质纹状体通路变性导致的运动障碍疾病。目前,PD的治疗只局限于症状的缓解,无法阻止神经元的持续变性。寻找阻止疾病进展的有效药物一直是国际关注的热点。氧化应激和自噬在PD发病机制中发挥着重要作用,且两者之间存在复杂的作用网络。天然抗氧化剂α-硫辛酸(α-lipoic acid,ALA)可以通过抗氧化应激保护神经元,但对PD自噬的调节作用尚鲜有报道。本课题将结合PD细胞和动物模型深入研究氧化应激和自噬的相互作用机制,及ALA通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)-腺嘌呤核糖核苷酸依赖的蛋白激酶(adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)及相关信号通路影响自噬的机制。本研究提出了ALA对于PD自噬的影响,并深入探讨其作用机制,将有助于深刻理解PD氧化应激和自噬的相互作用机制,为研发安全高效的PD药物治疗提供理论和实验依据。目的1.观察不同浓度及不同时间点的6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的存活率的影响,确定PD细胞模型的合适浓度及时间范围;观察ALA对6-OHDA诱导的帕金森病细胞模型的存活率、凋亡率、氧化应激水平的影响。2.观察ALA对6-OHDA诱导的帕金森病细胞模型自噬-溶酶体途径相关蛋白微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated protein l 1ight chain3,LC3)及自噬上游调控蛋白m TOR、AMPK表达水平影响。3.观察ALA对6-OHDA诱导的帕金森病大鼠神经元的保护作用。方法1.根据不同浓度及作用不同时间6-OHDA对SH-SY5Y细胞活性的影响,选择合适的6-OHDA处理浓度及时间。利用SH-SY5Y细胞经过6-OHDA处理制作帕金森细胞模型,再给予ALA进行干预。采用CCK-8法测定细胞活性,AnnexinⅤ与PI共染法检测细胞凋亡,荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的表达。2.GFP-LC3质粒转染观察GFP标记的LC3蛋白在帕金森细胞模型内的定位;Western blot法分析细胞内LC3-II、m TOR、磷酸化m TOR(phosph-m TOR,pm TOR)、AMPK、磷酸化AMPK(phosph-AMPK,p-AMPK)蛋白表达水平的变化。3.应用6-OHDA脑内注射建立PD大鼠模型,3周后进行各组大鼠的行为学检测,选取成功的大鼠模型,给予ALA药物干预2周后进行行为学检测,中脑黑质HE染色观察细胞形态,免疫组化法检测黑质酪氨酸羟化酶(throsine hydroxylase,TH)含量。最后均使用SPSS 22.0软件对结果进行统计学分析。结果1.6-OHDA对细胞活性产生了抑制作用,并且呈时间和浓度依赖性;6-OHDA组与对照组相比,细胞活性降低(P<0.01),细胞凋亡率升高(P<0.01),氧化应激水平升高(P<0.01)。与对照组相比,ALA组的上述指标均无明显变化;与6-OHDA组相比,ALA+6-OHDA组的细胞活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.01)、氧化应激水平降低(P<0.01)。2.6-OHDA组与对照组相比,LC3-II的表达升高(P<0.05),其中6h时表达最高;6-OHDA处理SH-SY5Y细胞12h,p-AMPK的表达升高(P<0.05),p-m TOR的表达降低(P<0.05);与对照组相比,ALA组的上述指标均无明显变化;与6-OHDA组相比,ALA+6-OHDA组的LC3-II的表达降低(P<0.05),p-AMPK的表达降低(P<0.05),p-m TOR的表达升高(P<0.05)。3.6-OHDA组与对照组相比,大鼠的行为能力明显降低,中脑黑质TH阳性神经元数量明显减少(P<0.05);与6-OHDA组相比,6-OHDA+ALA组大鼠的行为能力显著性增高,黑质中TH神经元的数量增加(P<0.05)。ALA低剂量组和高剂量组相比大鼠的行为能力和TH神经元数量无明显差异(P>0.05)。结论1.6-OHDA诱导了SH-SY5Y细胞的氧化应激和自噬,降低了细胞活性,ALA可能通过抑制氧化应激、抑制AMPK/m TOR通路介导的自噬减轻了6-OHDA诱导的细胞氧化损伤。2.ALA对6-OHDA诱导的帕金森病大鼠神经元有保护作用。