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目的:本研究以L-谷氨酸诱导体外纯化培养的视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡建立青光眼视神经损伤体外模型,通过观察疏肝通窍法中药含药血清干预后RGCs凋亡和活性的变化以及筛选RGCs差异表达的mi RNAs,预测青光眼治疗药物发挥作用的靶基因和相关通路,阐明疏肝通窍法治疗青光眼,保护视神经的作用机制。方法:1.原代分离纯化培养SD乳大鼠RGCs。2.L-谷氨酸体外培养RGCs,通过倒置显微镜、CCK-8检测和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测方法,观察RGCs形态学变化以及活性和凋亡的影响,建立RGCs凋亡体外模型。3.制备不同浓度的疏肝通窍法中药含药血清,通过CCK-8检测观察中药含药血清对正常体外纯化培养的RGCs活性的影响。4.将纯化培养的RGCs随机分为6组,包括:空白培养组,模型组,低、中、高剂量中药血清干预组和VB12干预组。空白培养组用细胞维持培养液稀释10倍的不含药的大鼠血清继续培养48h。模型组,低、中、高剂量中药血清干预组和VB12干预组经3.2mmol/L L-谷氨酸作用24h后,分别加入用细胞维持培养液稀释10倍的不含药的大鼠血清,低、中、高剂量中药血清和VB12母液培养24h。通过CCK-8检测各组细胞的活性,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。5.将纯化培养的RGCs随机分为4组,包括:空白培养组,模型组,中药血清干预组和VB12干预组。空白培养组用稀释10倍的不含药的大鼠血清继续培养48h。模型组,中药血清干预组和VB12干预组经3.2mmol/L L-谷氨酸作用24h后,分别加入用细胞维持培养液稀释10倍的不含药的大鼠血清,高剂量中药含药血清和VB12母液培养24h。提取各组RGCs总RNA进行mi RNA芯片杂交,筛选差异性表达的mi RNA,并通过q RT-PCR验证。运用Tar Pmi R和mi RTarget预测软件预测靶基因,并对靶基因进行GO和KEGG富集分析,预测疏肝通窍法发挥作用的相关通路。结果:1.体外纯化培养的RGCs可存活7天,细胞纯度达到了90%以上。2.浓度0.3mmol/L以上的L-谷氨酸作用12h以上,可诱导体外纯化培养RGCs凋亡,浓度为0.5、0.8、1.6、3.2、6.4mmol/L时RGCs的存活率的上升和凋亡率的下降变化明显,3.2mmol/L作用24h的细胞存活率下降至55.75±6.11%,适合后续实验的凋亡模型。3.CCK-8检测中药含药血清对正常体外纯化培养的RGCs活性的结果表明,不同剂量的中药含药血清对体外纯化培养RGCs的OD值与仅用细胞维持培养液培养细胞的空白组比较,均没有明显变化（P>0.05）。4.CCK-8检测各组RGCs活性的结果表明,体外纯化培养RGCs经3.2mmol/L的L-谷氨酸培养24h后细胞存活率与空白培养组比较明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。中、高剂量中药血清干预组和VB12干预组的细胞存活率均高于无含药血清的L-谷氨酸培养组（P<0.05）。其中高剂量中药血清干预组的细胞存活率高于中剂量中药血清干预组和VB12干预组（P<0.05）,差异有统计学意义。5.Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测各组RGCs的凋亡率结果表明,体外纯化培养RGCs经3.2mmol/L的L-谷氨酸培养24h后细胞凋亡率较正常培养组明显增加（P<0.05）,低、中、高剂量中药血清干预组和VB12干预组的细胞凋亡率均低于无含药血清的L-谷氨酸培养组（P<0.05）,其中高剂量中药血清干预组与VB12干预组的细胞凋亡率比较,有所减低,差异有统计学意义（P<0.05）。6.芯片分析结果表明,RGCs凋亡模型组vs空白培养组的差异表达mi RNA共计32个,其中上调表达15个,下调表达17个（P<0.05,|FC|≥2）;中药血清干预组vs RGCs凋亡模型组的差异表达mi RNA共计49个,其中上调表达24个,下调表达25个（P<0.05,|FC|≥2）;VB12干预组vs RGCs凋亡模型组的差异表达mi RNA共计20个,其中上调表达11个,下调表达9个（P<0.05,|FC|≥2）。进一步的差异表达mi RNA筛选结果表明,同时满足（RGCs凋亡模型组vs空白培养组）&（中药血清干预组vs RGCs凋亡模型组）比较,筛选出23个mi RNA（P<0.05,|FC|≥2）,其中10个mi RNA满足条件:（RGCs凋亡模型组vs空白培养组）&（中药血清干预组vs RGCs凋亡模型组）&（VB12干预组vs RGCs凋亡模型组）比较（P<0.05,|FC|≥2）。7.芯片分析结果表明,RGCs凋亡模型中mi RNA-132-3p、-222-3p、-29b-3p、-221-3p的表达下调,中药血清干预组此4种mi RNAs的表达均上调,VB12干预组前2种mi RNAs表达上调。8.q RT-PCR验证mi RNA-132-3p、-222-3p、-29b-3p、-221-3p的表达,和内参基因5S比较,曲线分析结果表明扩增产物的特异性和扩增效率较高;2-△△CT方法计算相对表达量的结果表明与芯片检测结果一致（P<0.05）。9.靶基因预测结果表明,差异表达的mi RNA可能是通过调控靶基因Slc6a1、Sox5、Melk、Kcna6、Hipk1、Rab1a、Zfp36l2、Fermt2、Cdkn1b、Ddit4、Igf1、Dot1l、Rere、Rarb和Fer发挥视神经保护作用。10.GO和KEGG富集分析结果表明,差异表达的mi RNA可能是通过调控凋亡,自噬,免疫反应,氧化应激反应,热休克蛋白,轴突,细胞增殖、分化等多条信号通路发挥作用。结论:1.浓度0.3mmol/L以上的L-谷氨酸作用12h以上,可诱导体外培养RGCs凋亡,3.2mmol/L作用24h的细胞存活率在50%～60%,是理想的RGCs凋亡模型,可用于青光眼视神经保护的基础研究。2.疏肝通窍法中药含药血清可以抑制体外纯化培养的L-谷氨酸诱导的RGCs凋亡,增强RGCs的活性,其作用呈浓度依赖性,高剂量中药含药血清的作用优于神经营养剂。3.疏肝通窍法通过调控mi RNA-132-3p、-222-3p、-29b-3p和-221-3p的表达发挥视神经保护作用,RGCs发生凋亡时其表达下调,疏肝通窍法干预后其表达上调。通过与神经营养剂VB12的比较,我们认为mi RNA-29b-3p和-221-3p是疏肝通窍法具有特异性表达的mi RNA。4.疏肝通窍法发挥青光眼视神经保护作用可能是通过调控mi RNA的表达,调节其靶基因和相关下游通路来完成的。相关的靶基因包括Slc6a1、Sox5、Melk、Kcna6、Hipk1、Rab1a、Zfp36l2、Fermt2、Cdkn1b、Ddit4、Igf1、Dot1l、Rere、Rarb和Fer。相关的信号通路包括凋亡,自噬,免疫反应,氧化应激反应,热休克蛋白,轴突,细胞增殖、分化等。