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背景国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF）最新数据统计显示,全球成年糖尿病患者达5.37亿,其中超过90%的患者属于2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）。T2DM并发症对患者健康、生活质量和寿命影响巨大,其中冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary artery disease,CAD）等大血管并发症是T2DM患者致残致死的最主要原因。T2DM患者发生CAD症状不典型、进展速度快、急性心血管事件风险高。因此,早期诊断CAD对T2DM患者具有重要意义。有创冠状动脉造影（invasive coronary angiography,ICA）是诊断冠心病的金标准,但由于其有创性,不能作为常用的筛查方法。除此之外,还有许多非侵入性检查可供选择,如:心电图、超声心动图、心脏放射性核素显像、冠脉CT血管成像（CT angiography,CTA）等,但准确性和适用性有限。因此,一种非侵入性的CAD诊断模型对T2DM患者尤为重要。肠道菌群是结构最复杂的微生物群落之一,在漫长的“协同进化”过程中与宿主形成了紧密的共生关系。随着近年来研究的逐渐深入,肠道菌群作为“第二基因组”在维持人体健康稳态中的作用越来越受重视,特别是在T2DM、CAD等代谢性疾病的发生发展中扮演重要角色。研究表明,T2DM患者中Firmicutes、Faecalibacterium prausnitzii（F.prausnitzii）和Bifidobacterium丰度降低,Betaproteobacteria、Clostridiales和Lactobacillus gasseri丰度升高,且Firmicutes-Bacteroidetes（F/B）比值升高与葡萄糖代谢异常显著相关。CAD患者肠道菌群研究显示,CAD患者中F.prausnitzii丰度降低,F/B比值升高,这和T2DM患者表现一致。有研究比较了合并T2DM的CAD患者与单纯CAD患者肠道菌群结构的改变,结果表明两组间肠道菌群的组成和多样性存在差异,与单纯CAD相比,合并T2DM的CAD患者Bacteroidetes丰度降低,而Firmicutes和Proteobacteria丰度升高;合并T2DM的CAD患者体内F.prausnitzii和Bacteroides fragilis等有益菌产生减少,Enterobacteriaceae、Streptococcus、Desulfovibrio等机会致病菌产生增加。然而,现有研究的重点是观察T2DM与CAD患者肠道菌群结构的改变,T2DM患者发生CAD后肠道菌群的改变未见报道,且暂未发现能够更好诊断T2DM中CAD患者的无创手段。为了解决上述问题,我们通过宏基因组测序分析了发生CAD的T2DM患者与单纯T2DM患者肠道菌群的特征,构建了T2DM患者以肠道菌群为基础的CAD诊断模型,并分别在两个独立队列中进行内部验证和外部验证。目的1.探讨T2DM患者发生CAD后肠道菌群、血清代谢产物的结构改变;2.构建T2DM患者中以肠道菌群为基础的CAD诊断模型。方法1研究对象招募选取2020年1月至2021年8月就诊于河南省人民医院因可疑CAD而行有创冠状动脉造影（invasive coronary angiography,ICA）的T2DM患者。ICA结果提示至少一根冠脉血管狭窄超过50%时定义为CAD。结合ICA结果分为发生CAD的T2DM组（T2DM+CAD）和单纯T2DM组（T2DM）。为扩大T2DM组的样本量,我们纳入了冠脉CTA为阴性的T2DM患者。最终共招募T2DM+CAD组66人,T2DM组33人作为发现队列。另外我们还招募了T2DM+CAD组21例和T2DM组14例作为内部验证队列。内部验证队列的纳入排除标准与发现队列相同。所有参与者均签署书面知情同意书。2临床资料收集收集所有受试者资料,分为基本信息和临床资料。基本信息包括:姓名、年龄、性别、身高、体重、体质指数（body mass index,BMI）、收缩压（systolic blood pressure,SBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）、当前吸烟史、饮酒史、糖尿病（diabetes mellitus,DM）病程、用药史,记录胸痛性质用于计算验前概率（pre-test probability,PTP）。临床资料包括:（1）空腹血糖（fasting blood-glucose,FBG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,Hb A1c）;（2）心肌酶谱:肌酸激酶（creatine kinase,CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB,CKMB）、肌钙蛋白I（cardiac troponin I,c Tn I）;（3）肝功能:丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）;（4）血脂代谢:总胆固醇（cholesterol total,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、高密度脂蛋白-胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）;（5）肾功能:肌酐（creatinine,CREA）、尿酸（uric acid,UA）、肾小球滤过率（estimate glomerular filtration rate,e GFR）;（6）ICA及冠脉CTA结果。所有受试者留取粪便标本进行宏基因组测序,留取血液标本进行非靶向代谢组学分析。3统计学分析使用SPSS 23.0软件进行统计分析。临床特征、用药情况、实验室化验数据中,计数资料以频数和百分数表示,用x2检验来检验两组间定性变量的差异;计量资料以x±s表示,Shapiro-Wilk检验分析是否符合正态性,使用Mann-Whitney U检验或独立样本t检验来检验两组间定量变量的差异。结果1一般临床资料比较1.1发现队列临床资料比较共招募了66例T2DM+CAD患者和33例T2DM患者作为发现队列。T2DM+CAD组和T2DM组间当前吸烟率（28.8 vs 9.1%）、抗血小板药物使用率（63.6 vs 30.0%）、HDL-C（1.01 vs 1.12mmol/L）、CREA（79.17 vs 58.68umol/L）、e GFR（79.53 vs92.32ml/（min*1.73m2））的差异显著（P＜0.05）。年龄、性别占比、SBP、DBP、BMI、DM病程、饮酒史、PTP、FBG、Hb A1c、心肌酶谱（CK、CKMB、c Tn I）、肝功能（ALT、AST）、UA、TC、TG、LDL-C无统计学意义（P＞0.05）。1.2内部验证队列临床资料比较共招募了21例T2DM+CAD患者和14例T2DM患者作为内部验证队列。内部验证队列中T2DM+CAD组和T2DM组间SBP（147.38 vs 133.71mm Hg）、DBP（88.05 vs77.79 mm Hg）、他汀药物使用率（76.2 vs 35.7%）、PTP（58.91 vs 58.91%）、e GFR（75.34 vs99.94 ml/（min*1.73m2））差异显著（P＜0.05）。年龄、性别占比、BMI、当前吸烟率、饮酒史、DM病程、FBG、Hb A1c、肝功能（ALT、AST）、CREA、UA、血脂代谢（TC、TG、HDL-C、LDL-C）无显著差异（P＞0.05）。2 T2DM患者发生CAD后的肠道菌群特征2.1 T2DM患者发生CAD后肠道菌群组成的差异性分析与T2DM组相比,T2DM+CAD组α-多样性降低,但无显著统计学差异（P＞0.05）。T2DM+CAD组与T2DM组肠道菌群结构在PCo A1水平上有明显分离（P＜0.05）。在属水平上,T2DM+CAD组主要表现为Bacteroides和Faecalibacterium丰度减少,Prevotella和Alistipes丰度增加。在种水平上,T2DM发生CAD后Prevotella copri丰度显著增加。在T2DM+CAD组中Prevotella copri、Alistipesputredinis、Bacteroidesstercoris、Bacteroidescaccae、Odoribactersplanchnicus、Barnesiellaintestinihominis、Alistipesfinegoldii、Bacteroidesfaecis、Viciacrypticvirus显著富集（P＜0.05）,而T2DM组中Escherichiaunclassified显著富集（P＜0.05）。2.2 T2DM患者发生CAD后肠道菌群功能富集分析通过对T2DM+CAD组与T2DM组肠道菌群功能富集分析,我们共发现415条通路,有32条在T2DM+CAD组和T2DM组间存在差异。其中核糖体、氨基糖和核苷酸糖代谢通路在T2DM+CAD组中富集,丙酮酸代谢、卟啉代谢、脂肪酸生物合成通路在T2DM组富集。3 T2DM患者发生CAD后的血清代谢物特征T2DM+CAD组与T2DM组血清代谢物组成差异显著（P＜0.001）。对血清代谢物丰度进行量化,发现147种代谢物丰度在组间存在差异。其中非索非那定、美地萘洛尔、人参三醇、嘧啶醇和β,β-二甲基丙烯酰紫草素在T2DM+CAD组中富集,2-甲基硫代苯并噻唑在T2DM组中富集。4肠道菌群与代谢物的相关性分析肠道菌群与血清代谢物之间的关联:TomatoyellowleafcurlChinabetasatellite丰度与羟基苯丁酮水平的降低和L-脯氨酸水平的升高有关。氨基苯酚水平与Fusobacteriumperiodonticum丰度呈正相关,与Alistipesputredinis丰度呈负相关。Prevotellacopri丰度与非索非那定水平成正相关。植物鞘氨醇水平与Bacteroidescaccae和Alistipesputredinis丰度呈负相关,与Fusobacteriumperiodonticum丰度呈正相关。Lachnospiraceaebacterium1157FAA丰度与野鸢尾黄素水平呈正相关。5构建T2DM患者中以肠道菌群为基础的CAD诊断模型5.1诊断模型的构建随机森林联合logistic回归法构建T2DM患者CAD诊断模型,最终选择了16个菌种作为生物标记菌建立诊断模型,包括Lachnospiraceaebacterium1157FAA、Prevotellacopri、Bacteroidescaccae、Bacteroidesstercoris、Oscillibacterunclassified、Odoribactersplanchnicus、Viciacrypticvirus、Holdemaniaunclassified、Klebsiellaunclassified、Clostridiumcitroniae、Bilophilaunclassified、Rothiamucilaginosa、Dasheenmosaicvirus、Bacteroideseggerthii、Escherichiaunclassified、Burkholderialesbacterium1147。其中重要性最高的菌种主要是Lachnospiraceaebacterium1157FAA、Prevotellacopri、Bacteroidescaccae、Bacteroidesstercoris。在T2DM+CAD组中相对富集的菌种包括Prevotellacopri、Bacteroidesstercoris、Bacteroidescaccae、Odoribactersplanchnicus、Lachnospiraceaebacterium1157FAA。在T2DM组中相对富集的菌种包括Bacteroideseggerthii、Clostridiumcitroniae、Rothiamucilaginosa、Holdemaniaunclassified。包含这16个菌种的模型可以准确诊断T2DM中的CAD患者（AUC 0.921）,且诊断准确性优于PTP（AUC 0.620）。5.2诊断模型的验证包含16个菌种的肠道菌群诊断模型在内部验证队列中仍能准确诊断T2DM中的CAD患者（AUC 0.932）,且诊断准确性优于PTP（AUC 0.794）。在Jie Z等人的研究队列中,选取68例合并T2DM的CAD患者和9例FBG＞6.1mmol/L或Hb A1c＞6.5%的患者作为外部验证队列,发现本研究构建的包含16个菌种的肠道菌群诊断模型仍具有良好的诊断准确性（AUC 0.912）。结论1.T2DM患者发生CAD后肠道菌群结构发生改变,Prevotellacopri等部分菌种丰度改变;2.包含16个关键菌种的肠道菌群诊断模型可以准确诊断T2DM患者中的CAD患者。