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第一部分沉默Robo1对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响 目的:研究Robo1对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。 方法:体外培养小鼠BMSCs，构建siRNA载体，通过脂质体转染BMSCs，靶向沉默Robo1，QPCR和Western blot法验证沉默效率，MTT和Brdu法检测沉默Robo1基因后对BMSCs增殖的影响。 结果:Robo1-siRNA转染BMSCs后， Robo1基因表达量相较于对照组Con-siRNA下调3倍左右，而且Robo1蛋白的表达水平相较于Con-siRNA组也明显下调;Con-siRNA和Robo1-siRNA分别转染BMSCs，MTT及Brdu法检测结果显示使用siRNA沉默Robo1基因的BMSCs细胞生长受到显著抑制，结论:Robo1与BMSCs生长密切相关，在Robo1被沉默后，BMSCs生长受到明显抑制。 第二部分靶向调控Robo1的miRNAs的筛选及鉴定 目的:筛选及鉴定靶向调控Robo1的miRNAs。 方法:用Targetscan、miRNAda等软件进行预测，以及文献查询，筛选出最有可能靶向抑制Robo1的miRNAs，并用miRNAs的mimic处理细胞，Westernblot检测BMSCs中Robo1的表达差异，找到能明显引起Robo1变化的miRNA。最后用双荧光素酶报告基因法验证miRNA对Robo1的靶向调控作用。 结果:利用生物信息学软件对Robo1可能的靶miRNAs进行了分析，从众多的靶miRNAs中筛选出最可能的靶miRNAs: miR-218、miR-29、miR-146、miR-148。分别用miR-218、miR-29a、miR-146和miR-148 mimics通过脂质体2000转染BMSCs，Westem blot结果显示，转染miR-29a时，Robo1下调最为明显。在转染克隆有野生型Robo13-UTR质粒的实验组中，检测荧光素酶活性显示miR-29组与空白组比较P＜0.01;miR-29组与阴性对照组比较P＜0.01，表明miR-29能与Robo1的3-UTR结合，从而抑制萤光素酶的活性;而在转染克隆有突变型mutRobo13-UTR质粒的实验组中，miR-29组与空白组和阴性对照组比较差异均无统计学意义，表明miR-29不能与mutRobo13-UTR结合而抑制萤光素酶的活性。 结论:miR-29a通过与Robo1的3-UTR结合而靶向抑制Robo1。 第三部分 miR-29a靶向调控Robo1抑制BMSCs增殖 目的:研究miR-29a靶向调控Robo1表达对BMSCs增殖的影响。 方法:采用慢病毒载体介导的miR-29a，根据miRNAbase上公布的pri-miR-29a的序列，合成并构建在慢病毒骨架质粒中，继而和慢病毒的包装质粒共转染工具细胞（293T，人胚肾细胞）进行慢病毒包装，继而裂解细胞，纯化带有pri-miR-29a的慢病毒颗粒，用于感染细胞并进行检测增殖的细胞实验。 结果:本实验成功构建和包装miR-29a慢病毒，然后选用BMSCs的代表株，通过MTT和Brdu法证明，过表达miR-29a可抑制BMSCs的增殖能力。real-time PCR和Western blot结果证明Robo1转染BMSCs后，Robo1表达量显著上调，过表达Robo1组可增强BMSCs增殖能力，而共转染miR-29a和Robo1可回复miR-29a对BMSCs增殖能力的抑制作用。 结论:miR-29a可通过靶向抑制Robo1的表达而抑制BMSCs的增殖。