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前言：
糖皮质激素是下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenalHPA)轴的最终激素,是一种重要的胰岛素拮抗激素。临床上大量应用糖皮质激素会引起糖耐量异常、胰岛素抵抗,甚至发展为类固醇糖尿病(steroiddiabetesSD)。目前SD定义为内源性皮质醇增多或糖皮质激素治疗所致的继发性糖尿病。国外研究认为长期使用糖皮质激素的病人患糖尿病的风险度为1.5到2.5。
目前的研究认为SD的发病机制包括:①通过骨骼肌途径(影响糖脂代谢);②通过肝脏途径(影响糖脂代谢);③降低胰岛素的释放;④引起胰岛细胞凋亡:国内外对此报道罕见。研究认为糖皮质激素可通过cAMP/PKA信号通路、PI3K/AKT信号通路、通过调节bcl-2/bax的比率及线粒体的去极化等途径引起胰岛细胞凋亡。而对于地塞米松是否可通过P38MAPK信号通路诱导胰岛细胞凋亡和胰岛细胞保护剂Ghrelin对地塞米松诱导胰岛细胞凋亡是否具有保护作用及与P38MAPK信号通路的关系国内外未见报道。
故本研究采用不同浓度不同时间Ghrelin作用于地塞米松诱导的胰岛细胞后检测细胞凋亡水平的变化,同时检测地塞米松诱导胰岛细胞凋亡是否可通过P38MAPK信号通路及此信号通路是否参与Ghrelin对胰岛细胞凋亡保护作用。从而为糖皮质激素对胰岛细胞毒性作用的保护及类固醇性糖尿病的防治提供可靠的实验依据。
材料与方法：
一、实验材料
大鼠胰岛细胞株INS-1(10-30代);Ghrelin,地塞米松,SB203580(P38MAPK信号通路阻断剂);Phospho-P38MAPK抗体;MTS凋亡检测试剂盒,Annexin-V-FITC-PI双染试剂盒。
二、实验方法
1、细胞培养
大鼠胰岛细胞株INS-1在RPMI1640培养基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2条件下进行培养。细胞单层生长达80-85%培养面积后,用于实验或细胞传代。
2、MTS凋亡检测
收集对数期细胞,以96孔板中不同浓度INS-1细胞接种数,观察作用3-4天确定最佳的细胞接种浓度。上述方法确定的最佳细胞接种浓度为1×104-4×104/孔,每孔中加入1×104个细胞,达到作用时间后,每孔中加入MTS试剂10ul,37℃孵育,1-4h内在酶联免疫检测仪490nm波长测定各孔OD值。每份标本均检测3个复孔。
3、AnnexinV-PI双染,流式细胞仪分析
收集细胞,用PBS洗涤并取1×105个细胞,离心后弃上清,加入300ul缓冲液悬浮细胞。加入5ulAnnexinV-FITC混匀后,加入5ulPI混匀。室温、避光、反应5～15min。1小时内流式细胞仪检测。每份标本均检测3个复孔。
4、WesternBlot(免疫印记)
应用细胞裂解液提取细胞蛋白,测定蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺凝胶,进行电泳,转膜,杂交。磷酸化P38MAPK上样量为100ug。ECL发光法测定目的条带,目的条带的灰度值用ScionImage软件分析。每份标本均检测3个复孔。
5、流式细胞仪检测Phospho-P38MAPK含量
收集细胞,使用甲醛溶液固定,甲醇穿孔,然后取5×105个细胞,离心弃上清,加入一抗孵育,离心弃上清,加入二抗孵育,离心弃上清,加入500ulPBS重悬,流式细胞仪上机检测。每份标本均检测3个复孔。结果采用WinMDI2.9软件分析。
6、统计学分析
采用SPSS19.0软件进行单因素方差(ANOVA)统计分析,结果用均数±标准差,组间差异比较采用Dunnetts检验,P＜0.05差异有显著性。
研究结果：
一、Ghrelin对地塞米松诱导大鼠胰岛β细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测AnnexinV-PI双染细胞分析与MTS检测结果相似。即胰岛细胞凋亡率在加入lnMGhrelin(43.53%)时与DEX组(46.70%)无明显差异(P＞0.05),从10nMGhrelin(27.95%)开始胰岛细胞凋亡率明显下降,在Ghrelin为100nM(9.05%)时胰岛细胞凋亡率最低与空白对照组(8.17%)无明显差异。
二、Phospho-P38MAPK表达与Ghrelin拮抗地塞米松诱导胰岛细胞凋亡的关系
流式细胞仪及WesternBlot检测结果:Phospho-p38MAPK含量DEX组明显高于对照组及SB组、DEX+SB组及DEX+Ghrelin组。同时SB组、DEX+SB组及DEX+Ghrelin组Phospho-p38MAPK蛋白水平表达基本相当。
三、P38MAPK信号通路对Ghrelin拮抗地塞米松诱导胰岛细胞凋亡率的影响
MTS及流式细胞仪检测胰岛细胞凋亡率结果:DEX组较对照组胰岛细胞凋亡率明显增加;SB组细胞凋亡率与对照组无明显差别,而凋亡率明显低于DEX组:DEX+SB组较DEX组细胞凋亡率下降但仍高于SB组和对照组。Ghrelin预处理组胰岛细胞凋亡率明显低于DEX组同时也低于DEX+SB组。
结论：
1、地塞米松可明显诱导大鼠胰岛细胞凋亡:
2、P38MAPK信号通路参与地塞米松诱导胰岛细胞凋亡过程;
3、Ghrelin可通过P38MAPK信号通路抑制地塞米松诱导胰岛细胞凋亡,对胰岛细胞凋亡具有明显保护作用。