论文部分内容阅读
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种发病率高、致残率高的严重神经系统疾病,可导致患者运动和感觉功能障碍。除运动功能障碍外,患者在SCI后会出现慢性神经痛、感觉错乱、感觉迟钝和感觉丧失等上行感觉传导束损伤症状,进而导致认知和心理障碍。目前针对脊髓损伤后感觉传导功能障碍缺乏行之有效的治疗手段,针对脊髓上行感觉传导通路损伤修复的研究较少,亟待有效的治疗策略能够促进脊髓损伤患者感觉功能改善,提升患者生存质量。近年来微小RNA(micro RNA,miRNA)的发现,为基因表达和信号转导通路靶点的精确调控提供了可能。miRNA能通过转录后翻译调控机制调整某些关键基因的表达来改变疾病的转归,并与其靶基因、靶蛋白相互作用形成网络调控机制。本课题组前期研究证明神经系统miRNA可通过多种形式调控初级感觉神经元(Primary sensory neuron,PSN)表型,促进脊髓上行感觉传导纤维的修复,参与神经细胞的分化、成熟,神经调质的释放等复杂的分子生物学过程。目的:本研究旨在通过体外及体内实验证明miR-30b能够通过Sema3A/NRP-1/Plexin A1/Rho A/ROCK通路调节初级感觉神经元轴突生长并促进脊髓损伤后索感觉传导功能修复。方法:1、4只成年雌性Wistar大鼠(250±10g)用来获取初级感觉神经元进行体外实验,36只成年雌性Wistar大鼠(250±10g)随机分为假手术组(T10椎板切除术)、阴性对照组(脊髓后索损伤造模+无义的寡聚核苷酸序列)以及Agomir组(脊髓后索损伤造模+miR-30b agomir)用于体内实验。2、运用生物信息学方法,通过MIRNAMAP,TARGETSCAN,STARBASE和MIRWALK2数据库,预测靶向sema3A的miRNA。3、应用双荧光素酶报告实验验证sema3A是miR-30b的靶基因,应用RT-q PCR检测sema3A mRNA来论证miR-30b是通过抑制还是降解的方式调控sema3A表达。4、应用miR-30b agomir或miR-30b antagomir在初级感觉神经元中进行转染。免疫共沉淀实验证实Sema3A与NRP-1/Plexin A1共受体结合。Western blot检测各组Sema3A、Sema3A/NRP-1复合物、Sema3A/Plexin A1复合物以及GTP-Rho A、ROCK蛋白含量。应用Image-pro plus 6.0检测各组轴突长度。以判断miR-30b对通路关键蛋白及轴突长度的影响。5、在抑制miR-30b的同时应用小干扰RNA(Small interfering RNA;si RNA)抑制sema3A的表达,论证sema3A是miR-30b调控轴突生长的关键靶基因。6、在抑制miR-30b或向PSN中加入Sema3A的同时,应用Rho A/ROCK通路抑制剂Y-27632后检测通路关键蛋白与轴突长度,用以证明miR-30b和Sema3A是通过Rho A/ROCK通路发挥轴突生长调控作用的。7、分别对初级感觉神经元以及脊髓进行免疫荧光,观察比较不同分组下神经元及脊髓的状态。8、应用Nogo A-Fc模拟轴突生长抑制性微环境。将初级感觉神经元分为Nogo A-Fc组与miR-30b agomir&Nogo A-Fc组,检测各组轴突长度,用以证明miR-30b能够促进PSN轴突在抑制性微环境中生长。9、体内实验用体感诱发电位及胶带移除实验验证脊髓后索损伤大鼠感觉功能的恢复。结果:1、miR-30b能够促进初级感觉神经元轴突生长。2、初级感觉神经元中miR-30b能够通过降解的方式来抑制sema3A mRNA的表达。3、初级感觉神经元中miR-30b通过靶向sema3A来调控Sema3A/NRP-1/Plexin A1复合物的形成。4、sema3A是miR-30b调节初级感觉神经元轴突生长的关键靶基因。5、Rho A/ROCK通路是miR-30b/Sema3A/NRP-1/Plexin A1轴调控初级感觉神经元轴突生长的细胞内关键下游途径。6、miR-30b能够在Nogo A-Fc抑制性微环境中促进初级感觉神经元轴突生长。7、miR-30b能够调节后索损伤大鼠背根神经节中Sema3A/NRP-1/Plexin A1/Rho A/ROCK通路。8、miR-30b能够促进脊髓后索损伤大鼠感觉传导功能恢复。结论:miR-30b能够通过降解sema3A mRNA的方式抑制sema3A自分泌,进而通过NRP-1/Plexin A1共受体以及细胞内Rho A/ROCK通路促进初级感觉神经元轴突在抑制性微环境生长,修复脊髓损伤大鼠后索感觉传导功能。