第一部分：Toll样受体4信号通路介导的人角膜细胞对棘阿米巴的炎性反应目的研究Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)信号通路在人永生化角膜上皮细胞(HUCLs)和基质细胞(THSFs)对棘阿米巴的炎性反应中的作用。方法培养永生化的人角膜上皮细胞(Telomerase-immortalized human epithelial cells, HUCLs)、角膜基质细胞(Telomerase-immortalized human stromal fibroblasts, THSFs),和棘阿米巴虫株。用一定浓度的棘阿米巴刺激两组HUCLs,刺激后的不同时间点收集细胞,Real Time-PCR检测TLR1-10mRNA、通路分子髓分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MyD88)、细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,ERK)、核转录因子NF-kB (nuclear transcription factor-KB, NF-kB)、c-jun氮端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)、p38mRNA的表达,筛选出受棘阿米巴刺激后表达发生变化的受体(TLR2,TLR4, TLR5)以及通路分子ERK和NF-kB, Western blot和免疫荧光检测TLR2、TLR4、TLR5、p-ERK、p-IkB的蛋白表达,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测炎性细胞因子白介素(interleukin, IL-8,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α,和干扰素(interferon, IFN)-β的水平变化。用TLR2, TLR4, TLR5对应中和抗体单独或联合应用预处理细胞后进行刺激并检测细胞因子的表达变化情况,分析起主要作用的受体。单独或联合应用特异性的通路抑制剂四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)或／和U0126 (1,4-Diamino- 2,3-dicyano- 1,4-bis (o-aminophenylmercapto) butadiene)预处理细胞,特异性封闭NF-kB通路或／和ERK通路后,用棘阿米巴刺激细胞并检测炎性细胞因子的表达变化情况,分析参与信号转导的信号通路。结果①TLR1-10筛选实验：HUCLs和THSFs受棘阿米巴刺激后,在被检测的10种Toll样受体中,TLR2, TLR4, TLR5mRNA表达以时间依赖方式呈现先增高后降低,其余几种TLR受体表达水平无变化。TLR4在mRNA和蛋白水平的表达均显著增高。TLR2在mRNA水平表达增高,在蛋白水平表达轻度增高。TLR5 mRNA表达略有升高,蛋白水平无明显变化。②LRs信号通路活化实验：棘阿米巴刺激HUCLs和THSFs后,通路分子MyD88、ERK、NF-kB、在mRNA和蛋白水平表达均明显增高,检测的细胞因子IL-8和TNF-α在细胞刺激后早期分泌增到,炎症反应中后期IFN-β分泌增多。③抗体封闭实验：单纯抗TLR4中和抗体预处理HUCLs和THSFs时,两种细胞分泌IL-8, TNF-α, IFN-β水平均明显下降。单纯TLR2或TLR5中和抗体预处理细胞时,细胞因子表达水平无明显增减,联合应用抗体预处理细胞时,仅在应用TLR4的条件下,细胞因子表达水平降低。④通路封闭实验：NF-kB特异性通路抑制剂PDTC预处理HUCLs和THSFs后,细胞因子IL-8和TNF-α的分泌水平降低,ERK通路特异性抑制剂U0126预处理HUCLs和THSFs后,细胞因子IFN-β的分泌降低。结论TLR4参与了HUCLs和THSFs对棘阿米巴的识别,在细胞受刺激后早期通过TLR4-MyD88-NF-kB通路诱导下游炎性细胞因子IL-8和TNF-a的产生,并在炎症反应中后期通过TLR4-ERK通路诱导下游炎性细胞因子IFN-β,介导角膜细胞的炎性反应。第二部分：棘阿米巴角膜炎模型的建立及TLR4信号通路的体内作用研究目的应用三种不同方法建立棘阿米巴角膜炎的大鼠和小鼠模型,分析各种方法的优缺点和适用范围,并研究Toll样受体4信号通路在棘阿米巴角膜炎的Wistar大鼠模型中的作用。方法Wistar大鼠和昆明小鼠各45只,随机分为A、B、C组,每组15只。分别采用角膜划伤-棘阿米巴刺激-睑裂缝合法(A组),角膜划伤-接触镜片覆盖方法(B组),基质层内注射棘阿米巴悬液方法(C组)建立模型。每组取5只,在刺激后不同时间点取角膜,行角膜切片HE染色寻找棘阿米巴滋养体和包囊。剩余每组10只,分别用裂隙灯观察、10%KOH湿封片法、角膜刮除物培养法、炎症程度分级等方法分析各组动物模型成功率、炎症的严重程度。角膜划伤-棘阿米巴刺激法建立棘阿米巴角膜炎的Wistar大鼠模型,模型建立后1,3,7,13,21天处死大鼠并收集角膜,以实时定量PCR方法检测大鼠角膜组织中TLR2、TLR4、核转录因子(nuclear factor, NF)-kB,胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK),白介素(interleukin, ID-8,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α,和干扰素(interferon, IFN)-β等分子的mRNA表达水平。Western blot及免疫荧光组织化学检测TLR2、TLR4、p-Erkl/2,和p-IkB蛋白质的表达。单独或联合应用特异性的通路抑制剂PDTC或／和U0126预处理大鼠,特异性封闭NF-kB通路或／和ERK通路后,建立棘阿米巴角膜炎的大鼠模型,并检测炎性细胞因子的表达变化情况,分析参与信号转导的信号通路。结果A组中,有4只大鼠、6只小鼠发生炎症反应,B组中,有7只大鼠和8只小鼠发生炎症反应,C组中,有10只大鼠和10只小鼠产生角膜炎症反应。所有发生炎症的动物经各种方法均证实仅为棘阿米巴感染,无其它合并感染。其中A组和B组动物表现出典型的棘阿米巴角膜炎的病理和临床病程,C组能够更快的建立棘阿米巴角膜炎的模型,迅速形成角膜环形溃疡、基质脓肿等,但不能模拟正常人体感染过程。在棘阿米巴角膜炎的Wistar大鼠模型的角膜组织中,TLR4,通路分子NF-kB, p-IkB和p-Erk1/2,以及细胞因子IL-8, TNF-α, IFN-β表达水平均明显增高。PDTC预处理组大鼠角膜组织中的炎性细胞因子IL-8和TNF-α水平明显降低,U0126预处理组大鼠角膜组织中炎性细胞因子IFN-β表达水平明显降低。结论基质层内注射法能够更有效的建立鼠的棘阿米巴角膜炎模型。角膜划伤-眼睑缝合法在大小鼠中成功率均较低,但较好的模拟了角膜自然感染过程。角膜划伤-角膜接触镜覆盖法效果介于上述两者之间,较好模拟了因佩戴接触镜导致的角膜感染过程。TLR4在Wistar大鼠体内参与识别棘阿米巴入侵角膜的过程,并分别通过TLR4-NF-kB和TLR4-Erk1/2诱导炎性细胞因子IL-8, TNF-α,和IFN-β的合成。第三部分：甘露糖在棘阿米巴诱导角膜上皮细胞激活TLR4信号通路过程中的作用目的探讨甘露糖在棘阿米巴诱导角膜上皮细胞激活Toll样受体4信号转导通路过程中的作用。方法培养永生化的人类角膜上皮细胞(Telomerase-immortalized human corneal epithelial cells HUCLs)和棘阿米巴虫株,在甘露糖存在或缺失的条件下,用一定浓度的棘阿米巴刺激HUCLs,刺激后4小时收集细胞,Real Time-PCR检测TLR4以及通路分子NF-kB、Erk1/2在mRNA水平的表达,Western blot和免疫荧光方法检测TLR4以及磷酸化的通路分子p-IkB、p-Erk1/2的表达,ELISA检测炎性细胞因子IL-8, TNF-α, IFN-β的水平变化。用细胞通路抑制剂PDTC和／或U0126预处理HUCLs,在甘露糖存在或缺失的条件下,重复棘阿米巴刺激过程,ELISA方法检测炎性细胞因子TNF-α, IL-8, IFN-β的水平变化。结果HUCLs受棘阿米巴刺激后,TLR4表达明显升高。通路分子NF-k B, p-IkB、p-Erk1/2以及炎性细胞因子TNF-α、IL-8和IFN-βmRNA表达增高。甘露糖预处理组TLR4、通路分子及炎性细胞因子表达水平高于正常细胞组,低于无甘露糖处理组。通路抑制实验显示,PDTC预处理组炎性细胞因子TNF-α和IL-8的表达降低,U0126可降低IFN-β的表达。相比未加甘露糖预处理的细胞组,甘露糖预处理组加入通路抑制剂后,炎性细胞因子表达降低更明显。结论：甘露糖可部分抑制棘阿米巴对TLR4信号通路的激活,从而抑制其诱导的炎性细胞因子的合成。甘露糖与TLR通路抑制剂同时作用,可显著抑制棘阿米巴诱导的炎性细胞因子合成。