帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病,由于早期黑质致密部的多巴胺(dopamine, DA)能神经元死亡而出现多巴胺耗竭,导致出现以运动迟缓、静止性震颤、肌强直等为特征的运动障碍。PD也会出现很多非运动症状,如轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment in Parkisnon’s disease, PD-MCI)、痴呆、情绪和精神障碍等。中脑黑质DA能神经元缺失、α-突触核蛋白(a-synuclein)沉积和路易小体形成是PD的主要病理特征。目前PD的治疗是以增加DA浓度及直接的DA受体激动剂为主的症状性治疗。疾病修饰治疗可减缓神经变性或遏制疾病的进展,但目前PD的疾病修饰治疗仍有待进一步探索。因此,阐明PD的发病机制将有助于疾病修饰治疗的发展。由于大部分PD患者为散发性,很可能由遗传因素和环境因素相互作用而导致。自从20年前在PD患者中首次报道小胶质细胞活化介导的神经炎症,PD神经炎症成为了研究的焦点。众所周知,小胶质细胞同时具有细胞毒性及细胞保护性功能。小胶质细胞既可活化为致炎的M1型(或过度活化型),也可活化为抗炎的M2型。M1型小胶质细胞可产生并释放多种致炎因子,促进清除中枢神经系统的病原体如伐-突触核蛋白,但过度活化的小胶质细胞可因产生过多具有神经毒性的细胞因子,反而造成神经元损伤继而加重PD。相反,M2型小胶质细胞可产生抗炎因子、抑制炎症反应、促进组织修复。因此,通过调控小胶质细胞的亚型分化,促进小胶质细胞向抗炎的M2型小胶质细胞转化,将可能为PD提供新的治疗策略,但目前小胶质细胞亚型分化的调控机制尚未明确。髓样细胞表达的触发受体-2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2, TREM2)是表达于小胶质细胞表面的受体,可减少小胶质细胞介导的炎症因子导致的促炎反应,并促进小胶质细胞对神经元碎片及细菌的吞噬作用。最近一项大型的GWAS研究表明TREM2基因突变与PD、AD、FTD等发病风险增加有关。TREM2可能是调节PD中小胶质细胞M1/M2亚型平衡的重要因素。本研究将通过临床研究PD患者外周血中TREM2表达水平与对照组的差异,并建立PD小鼠模型初步探讨TREM2及其下游神经炎症因子的表达水平,进一步通过TREM2-shRNA及wtTREM2慢病毒转染小胶质细胞以使TREM2表达沉默或过表达,然后分析TREM2表达水平对小胶质细胞M1/M2亚型分化的影响,以探讨TREM2对小胶质细胞亚型分化的调控作用,以阐明TREM2在小胶质细胞介导的神经炎症中的作用。第一章可溶性TREM2在PD及PD认知障碍中的表达水平研究目的：研究sTREM2在PD患者和正常对照者间的表达差异,并探讨sTREM2对PD认知功能障碍的影响。方法：研究纳入114例PD患者和120例健康对照者,收集一般临床资料,采用统一帕金森病评分量表(Unified Parkinson Disease Rating Scale, UPDRS)第1U部分评估PD患者的运动功能,通过MoCA(Montreal Cognitive Assessment, MoCA)量表评估整体认知功能、韦氏智力和韦氏记忆量表评估执行功能、记忆、注意力及视空间空能。进一步根据PD轻度认知功能障碍的诊断标准,将PD组分为PD认知正常组(PD patients with normal cognition, PD-CN组)和PD轻度认知功能障碍组(PD patients with cognitive impairment,PD-MCI组),其中PD-CN组66例,PD-MCI组48例。并采集PD组及对照组的外周血,用ELISA法检测外周血中sTREM2的表达水平,分析各组外周血中sTREM2表达水平的差异,并进一步探讨sTREM2在PD认知功能中的作用。结果：①114例PD思看中,PD-MCI思者48例,占42.11%。PD-MCI组的受教育水平较PD-CN组低(P<0.05)；运动功能(UPDRS-III评分、H-Y分级)及整体认知功能(MMSE评分及MoCA评分)均较PD-CN组更差,差异有统计学意义(P<0.05)；②PD患者外周血中sTREM2表达水平显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.001)；③健康对照组、PD-CN组和PD-MCI组三组间外周血sTREM2表达水平有显著性差异(P<0.001), PD-MCI组患者外周血中的sTREM2表达水平显著高于PD-CN组,差异有统计学意义(P<0.001)；④PD患者外周血中的sTREM2水平与MoCA评分呈中度负相关(r=-0.464,P<0.001);⑤PD患者外周血中的sTREM2水平升高与受教育年限水平低(P=0.023)、相似性量表分(P=-0.015)及再认量表分(P=-0.018)下降相关。结论：PD患者外周血的sTREM2表达水平升高与PD患者受教育年限低、全面认知功能下降、执行功能及记忆功能下降有关,外周血的sTREM2表达水平可能有助于监测PD及PD认知障碍的病情进展,表明TREM2可能参与了PD及PD认知功能障碍的发生发展,但内在机制仍有待进一步研究。第二章TREM2对MPTP诱导的PD小鼠模型神经炎症的影响目的：分析MPTP诱导的PD小鼠模型和正常对照小鼠脑组织中TREM2、促炎因子及抗炎因子的表达水平差异,探讨TREM2在PD小鼠神经炎症中的作用。方法：通过C57BL/6J小鼠小剂量长期腹腔注射MPTP和丙磺舒建立PD慢性模型,另设丙磺舒对照组和生理盐水对照组。建立PD模型后,取各组小鼠中脑、皮层、海马、纹状体等部位脑组织,通过酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)染色观察中脑DA能神经元死亡情况,并采用荧光定量PCR方法检测：rREM2及炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-a基因的mRNA表达水平,进一步通过western blot检测TREM2及抗炎因子Arginase-1蛋白的表达水平,最后应用单因素方差分析比较三组间DA能神经元缺失、TREM2、炎症因子及抗炎因子的表达水平差异。结果：①MPTP模型组中TH染色阳性DA能神经元数目较丙磺舒对照组及生理盐水对照组显著减少(P<0.001),MPTP组小鼠中脑TH+神经元数目较生理盐水对照组减少39.7%：②MPTP模型组、丙磺舒对照组及生理盐水对照组之间中脑及皮层中TREM2、 IL-1β、IL-6, TNF-a基因的mRNA相对表达水平有显著性差异(P<0.05),其中MPTP组表达水平最高,差异有统计学意义(P<0.05)；③MPTP模型组、丙磺舒对照组及生理盐水对照组三组间中脑、皮层、纹状体及海马组织中TREM2及抗炎因子Arginase-1蛋白的表达水平有显著性差异(P<0.05),其中MPTP组表达水平高于丙磺舒对照组及生理盐水对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；结论：MPTP诱导的PD小鼠模型中脑、纹状体、海马及皮层等部位脑组织均出现TREM2及抗炎因子Arginase-1蛋白表达增加,伴有中脑DA能神经元缺失及显著的神经炎症,提示TREM2与PD中脑DA能神经元缺失及神经炎症有密切的联系,可能是PD出现神经炎症的情况下为了阻止炎症反应而出现的代偿性升高,但其确切机制有待进一步阐明。第三章TREM2对小胶质细胞亚型分化的调节作用目的：初步探讨TREM2是否在小胶质细胞M1/M2亚型分化中发挥调控作用。方法：选用BV2细胞作为小胶质细胞模型,用TREM2-shRNA’慢病毒感染小胶质细胞使TREM2沉默表达,wtTREM2’慢病毒使小胶质细胞过表达TREM2,并分别设阴性对照病毒感染组,感染96小时后通过免疫荧光、荧光定量PCR及western blot验证感染效率。各组慢病毒感染后根据加入M1型小胶质细胞诱导剂(IL-4+IL-13)或M2型小胶质细胞诱导剂(LPS+IFN-y)的不同,再将小胶质细胞分为3组：对照组、IL-4 (1 Ong/ml)+IL-13(10ng/ml)组、LPS(100ng/ml)) +IFN-y (1 Ong/ml)组。感染96小时后各组分别加入相应浓度的M1/M2型诱导剂,24小时后通过免疫荧光、western blot及荧光定量PCR检测小胶质细胞上TREM2及抗炎因子Arginase-1的表达水平,并采用Griess法检测炎症因子NO的表达水平。结果：①TREM2-shRNA慢病毒及scramble TREM2阴性对照病毒、wtTREM2慢病毒及vector阴性对照病毒感染小胶质细胞后,免疫荧光结果表明TREM2-shRNA’陧病毒及scramble TREM2阴性对照病毒、vector阴性对照病毒在小胶质细胞中的感染效率均达90%以上,wtTREM2慢病毒的感染效率达80%以上,可保证后续研究的进行；②慢病毒感染小胶质细胞后,TREM2-shRNA组TREM2及M2型小胶质细胞标志物Arginase-1蛋白的表达水平较scramble TREM2组显著下降(P<0.05),相反,wtTREM2组TREM2及Arginase-1蛋白的表达水平较vector组显著升高(P<0.05)：③慢病毒感染小胶质细胞并利用M1/M2型小胶质细胞诱导剂后,IL-4+IL-13(M2型小胶质细胞诱导剂)组的TREM2及M2型小胶质细胞标志物Arginase-1表达水平较对照组升高,M1型小胶质细胞标志物NO表达减少(P<0.05),而LPS+IFN-γ(M1型小胶质细胞诱导剂)组恰好相反,TREM2及Arginase-1表达水平较对照组降低,NO表达增加(P<0.05),表明小胶质细胞在M1型/M2型诱导剂下出现了亚型转化；④沉默TREM2表达后,TREM2及M2型小胶质细胞标志物Arginase-1表达水平显著下降,而使用M2型小胶质细胞诱导剂IL-4/IL-13可诱导其表达增加；相反,TREM2过表达后,TREM2及Arginase-1表达水平显著增加,而使用M1型小胶质细胞诱导剂LPS/IFN-γ可诱导其表达下降；表明TREM2可促进小胶质细胞从M1型向M2型转化。结论：(1)在没有使用M1型诱导剂的情况下,TREM2沉默表达即可减弱小胶质细胞向M2型分化的功能,表明TREM2在M2型小胶质细胞分化中发挥着重要的作用,可能参与了PD神经炎症的发病机制；(2) TREM2沉默表达可抑制小胶质细胞向M2型分化而加重M1型小胶质细胞介导的炎症反应,相反,TREM2过表达可诱导小胶质细胞向M2型转化,抑制M1型小胶质细胞介导的炎症反应并产生抗炎因子,表明TREM2在PD神经炎症中发挥保护作用,但TREM2如何调节小胶质细胞M1/M2亚型分化的具体分子机制有待进一步阐明。