申嗪霉素(吩嗪-1-羧酸)是由上海交通大学许煜泉教授课题组从假单胞菌株M18(Pseudomonas spp. M18)的次生代谢物质中分离提取出来的活性物质,它能有效抑制多种农作物病原菌的生长,具有安全、高效、对环境友好等特点,是一种新型的微生物源绿色农药。本实验室前期研究表明申嗪霉对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的生长具有强烈抑制作用,平均有效中浓度EC50为0.110μg/mL,最低抑制浓度(MIC)<12.5ug/ml。盆钵实验用200μg.a.i./ml申嗪霉素喷雾,对水稻白叶枯病的预防效果可达79.81%,具有良好的应用前景。有文献报道,吩嗪化合物结构中有吩嗪环,能根据目标细胞内的氧化还原压力选择失去或得到电子,打破原有的氧化还原平衡,但目前未见申嗪霉素作用机理的报道。因此为了进一步明确申嗪霉素对Xoo的作用机理,本研究在前期研究的基础上,借助Biolog碳源利用鉴定技术、荧光探针加载技术和丙酮酸脱氢酶活性测定等生理生化手段验证申嗪霉素是否影响Xoo的能量代谢,并寻找出药剂干扰的代谢途径。借助SacB介导的无标记基因敲除技术,探究申嗪霉素对Xoo的作用机理与NADH脱氢酶问的相关性,试图构建申嗪霉素对Xoo的作用机制模型。取得结果如下：Xoo用申嗪霉素处理后碳源利用曲线存在差异,且差异存在一定的规律性。药剂处理后,共有10种碳源利用存在差异,其中糖类及衍生物5种,羧酸衍生物5种。Xoo对α-D-葡萄糖和丙酮酸甲酯的利用较少(比色值～60)药剂处理后利用量增加,增加量约为4倍；对D-甘露糖、L-乳酸、L-苹果酸和蔗糖的利用趋势相似,药剂处理后的利用量(比色值-200)是未处理的(比色值～150)1.5倍；对D-半乳糖、柠檬酸、α-酮戊二酸和N-乙酰-D-葡糖胺的利用量较多(比色值-250),药剂处理后的利用量与未处理间无明显差异。申嗪霉素处理后,Xoo菌体和粗酶液中的丙酮酸脱氢酶E1活性都受到抑制,但还未清楚为何有抑制作用。将DCFH-DA荧光探针加载到Xoo中,用不同条件处理菌体,然后实时监测荧光信号变化。结果发现申嗪霉素处理后菌体会产生大量的活性氧,且含量高于活性氧阳性对照,同时随着药剂浓度的升高,产生活性氧的量也增多。随着时间的变化,药剂处理的菌体产生活性氧的速率也开始减缓,证明申嗪霉素对菌体的影响在处理前期更为强烈。参考实验室徐曙博士建立的Xoo蛋白质组参考图谱和蛋白点鉴定结果,发现NADH脱氢酶C亚基(168号和401号点)、G亚基(230、231和355号点)和NADH-泛醌氧化还原酶NQ03亚基(232号点)是呼吸电子传递链复合物Ⅰ的亚基,在能量产生中具有重要作用,同时也被认为是活性氧的主要来源。因此,本研究选取NADH脱氢酶作为目标蛋白用于后续研究。采用pKl 8mobGⅡ载体和SacB介导的无标记基因敲除技术,对Xoo NADH脱氢酶16个亚基编码基因进行敲除。共获得11个亚基基因突变体,分别是△nuoA.△nuoB.△nuoC.△nuoD.△nuoE.△nuoF.△nuoI. △nuoJ.△nuoK.△nuoN和△ndhF.与野生型ZJ173相比,突变体对申嗪霉素敏感性均下降,下降的水平与敲除的亚基基因不同有关。△nuoE.△nuoF.△nuoI和△ nuoN的EC50与野生型ZJ173的EC50差异显著,而△nuoD和△ndhF的EC50与野生型ZJ173的EC50差异极显著。活性氧产量测定发现药剂处理后突变体能产生大量的活性氧,且含量高于野生型ZJ173,同时随着突变体EC50的升高,活性氧产量也增多；突变体对外源H2O2的耐受力也增强,增强程度因敲除的亚基基因不同而不同。△nuoD.△nuoE.△nuoF.△nuoI和△nuoN在0.1mM外源H202的胁迫下生长良好,在0.25mM下则不能生长。△ndhF在0.25mmM外源H202胁迫下也能正常生长,荧光定量结果显示,抗氧化相关基因KatE表达水平在△ndhF显著提高,这与抗氧化结果相一致；表型测定显示,突变体在基本培养基中的生长前期与野生型ZJ173基本一致,后期生长能力减弱,低于对照菌株,说明生长后期病菌的生长速度受到抑制或者裂解速度比野生型快。△nuoE.△nuoI和△ndhF胞外多糖产量有所降低,但未影响对寄主水稻的致病力。这些结果表明,活性氧的累积是导致菌体细胞死亡的主要因素,Xoo对申嗪霉素的敏感性与NADH脱氢酶存在一定的相关性。申嗪霉素在菌体内可作为电子载体,形成自身氧化还原体系,导致正常的氧化还原途径受阻,使电子传递链质子势差无法正常产生,造成ATP合成过程中缺乏质子动力,使得ATP合成受阻,最终导致菌体因缺乏能量而死亡。但仍未清楚NADH脱氢酶是否为申嗪霉素的作用靶标,还需进一步的实验支持。