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目的：通过研究脂肪间充质干细胞增强血管内皮细胞的功能活性,进一步明确脂肪间充质干细胞促进血管生成的生物学效应,进而验证和了解脂肪间充质干细胞对血管内皮细胞发挥作用的分子机制，探讨AD-MSCs促进HUVECs发挥功能活性的途径,为进一步研究脂肪间充质干细胞及无细胞治疗体系在临床应用奠定基础。方法：第一部分细胞分离培养与鉴定①分离培养脂肪间充质干细胞脂肪组织来自健康女性吸脂者,经组织标本所属人知情。②用诱导液对分离培养的脂肪来源干细胞进行鉴定。诱导其向脂肪细胞及骨细胞方向分化,分别用油红0和茜素红-S检测其向成脂和成骨分化。③通过流式细胞仪明确人脐静脉内皮细胞CD31阳性细胞的百分比。第二部分选取第3-6代生长状态良好的脂肪间充质干细胞,由原来含10%FBS的DMEM高糖培养液换成无血清的DMEM高糖培养液,过夜收集其上清液,离心后加入3%和5%的FBS备用。用含相应浓度FBS的DMEM设立正常对照组,分别进行内皮细胞的增殖实验、划痕实验、Matrigel成管实验、Matrigel三维培养的出茅实验。计数统计表示用均数±标准差(x±SD)差表示,第三部分分子机制研究①用双抗体夹心ELISA去检测收集上清液VEGF浓度；②在Transwell体系间接共培养,观察HUVEC在AD-MSCs的诱导下迁移。③用双抗体夹心ELISA法测定Transwell培养体系中VEGF浓度水平；④分析培养体系中AD-MSCs与HUVECs分泌VEGF勺差异性。⑤提取相应HUVECs的总蛋白和总RNA。进行、Vestern blot检测，测定HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3蛋白的表达；⑥以提取的RNA为模板,转录合成cDNA，进一步进行Real-time PCR,检测HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3的mRNA表达水平。结果：第一部分.①人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和AD-MSCs在10%FBS的DMEM高糖培养液流式鉴定培养下生长良好。②培养的人脐静脉血管内皮细胞细胞免疫组织化学CD31阳性,定位于细胞膜。③FCM结果显示,CD31阳性细胞数占检测总数的98.3%,CD34阳性细胞仅占检测总数的0.016%。④脂肪间充质干细胞能定向诱导成脂肪细胞即骨细胞，油红O和茜素红S检测阳性。第二部分①CCK-8细胞增殖活力检测 用MSC-CM处理的HUVECs 24小时与对照组P值<0.01,两者具有显著的统计学意义。培养36小时后,P值<0.05,两者有统计学意义。②划痕实验MSC-CM组在前六小时的迁移速率就高于Control组。至12小时，MSC-CM组细胞侵入面积已达42%,而对照组仅为10%左右。③管腔形成实验中,实验组节点数平均为21个/视野,而对照组为12个/视野,成组T检验得知P<0.001,具有极其显著的统计学意义。④出芽实验亦显示,实验组与Control组P=0.004,两者具有极显著的统计学意义。第三部分①脂肪间充质干细胞上清的VEGF浓度与脐静脉内皮细胞上清中VEGF的浓度两者具有显著的统计学意义(P<0.01)。迁移实验②Transwells诱导组与对AD-MSC照组两者具有极其显著的统计学意义(P<0.001)。③来自组的上清液中AD-MSCs浓度为26.87±2.7VEGF而7pg/mL,组则仅为7.65±1.2Vehicle(表3-6),两者有极其显3pg/mL著的统计学意义(P<0.001)。④每1×104个细胞为单位,与HUCVEC-CM之间MS C-CM比较分泌的量有显著的统计学差异(P<0.01)：⑤经MSC-CM处理的VRGF其表达HUVECs,蛋白的相对表达量均上调,⑥VEGF、HIF-1α及Cdk5Rap3结果相与Western Blot似，各自的表达均有增加。nRNA结论：可以促进AD-MSCs的生物学增殖、迁移、管腔结构形成效应,其外HUVECs在通过分泌等促进VEGF的功能活性,内在通过调节效应蛋白分子VEGF、H1F-1αHUVECs及3表达。CDK5RAP