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研究背景:机体在缺血、缺氧、炎症、损伤等病理条件下,局部组织细胞糖代谢发生转变,有氧糖代谢减少,无氧糖酵解增多,造成乳酸等酸性产物局部堆积,引起内环境pH值降低、细胞外环境酸化,从而对多种细胞功能产生影响。在这种病理因素刺激下,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)将去分化获得较强的增殖和迁移能力导致血管重构,这种改变是高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等心血管疾病的病理生理学基础之一。而最近研究较热门的酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)的刺激诱因即为内环境中的低pH及H+,激活后介导阳离子内流引发下游的MAPK、ERK1/2等信号通道发挥作用,从而对血管平滑肌细胞的活动产生影响。本研究通过体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,模拟病理刺激下pH变化,设置多组对照实验,探究酸敏感离子通道激活后血管平滑肌细胞的功能改变及在ASIC 1a特异性抑制剂及姜黄素作用于通道后细胞功能的变化,为药物的开发提供新的靶点以及拓宽姜黄素的临床应用提供基础实验依据。目的:通过体外模拟病理刺激下pH变化,探究酸敏感离子通道激活后血管平滑肌细胞的功能改变及在ASIC 1a特异性抑制剂、姜黄素对通道的作用以及细胞功能发生的变化。方法:1.VSMCs的培养及鉴别:采用细胞贴块法。通过分离大鼠主动脉血管,剥去血管外膜,刮除血管内膜,将中膜血管剪碎成小的组织块,组织块浸在培养瓶中培养5-7d。使用流式细胞法、细胞抗a-SMA抗体鉴定细胞纯度。实验所用的血管平滑肌细胞均为第4~6代的细胞;2.检测酸性环境下血管平滑肌细胞ASCIS 1a的表达量:设置分组:pH6.9+空白对照,p H6.9+姜黄素(20μmoL/L),pH6.9+PCTX1、pH6.9+PCTX1+姜黄素(20μmo L/L),p H7.4+空白对照共五组。采用Western-Blot法检测各组ASICS 1a蛋白表达;3.检测酸性环境下细胞内磷酸化ERK1/2蛋白的表达量:设置分组:1.pH7.4+空白对照组;2.pH6.9+空白对照组;3.pH6.9+姜黄素;4.pH6.9+PCTX1;5.pH6.9+PD98059;6.pH6.9+姜黄素+PD98059;7.p H6.9+PCTX-1+PD98059共七组。采用Western-Blot法检测各组ERK1/2蛋白表达;4.CCK-8法测定血管平滑肌细胞的增殖:设置分组:1.p H7.4+空白对照;2.pH6.9+空白对照;3.pH6.9+姜黄素(20μmoL/L);4.pH6.9+PCTX1;5.pH6.9+PCTX1+姜黄素(20μmoL/L);采用CCK-8法检测各分组的细胞活性及增殖率。结果:1.与对照组相比,酸化环境刺激下血管平滑肌细胞表达ASIC 1a增多(P<0.05),在特异性抑制剂PCTX-1及姜黄素分别作用下,ASIC 1a的表达不同程度被抑制(P<0.05)。在两者共同作用下,ASIC 1a的表达与对照组无显著差异(P>0.05);2.与对照组相比,酸化环境刺激下,VSMC胞内的磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显增加(P<0.05)。而在姜黄素、PCTX-1及ERK1/2通路抑制剂PD98059三种因素分别作用下细胞磷酸化ERK1/2蛋白的表达均被抑制,且各组抑制程度不同(P<0.05)。姜黄素加PD98059实验组及PCTX-1加PD98059实验组在原有抑制程度上更有明显加强,且两组的抑制程度不同(P<0.05),但两者与对照组相比仍有差异(P<0.05);3.与对照组相比,酸化环境下血管平滑肌(VSMC)的OD值下降(P<0.05),考虑可能存在钙离子介导的细胞损伤。而在姜黄素、PCTX-1以及两者共同作用下各组OD值均明显降低(P<0.05),且各有差异;增殖活力方面,酸化刺激下组明显高于其他各组,差异有统计学意义。而在姜黄素、PCTX-1及两者共同作用下,细胞的增殖活力被抑制,且抑制程度不同(P<0.05)。姜黄素与PCTX-1共同作用下,对细胞增殖抑制程度最大。结论:在缺血缺氧所致酸化环境下,大鼠胸主动脉血管平滑肌上的ASIC 1a表达增多,引起细胞内ERK1/2磷酸化,从而对血管平滑肌的增殖进行调控,而姜黄素则表现出抑制作用。提示酸化环境ASIC可能是姜黄素抑制血管平滑肌细胞增殖的作用途径之一。