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目的：Cdk7在细胞周期进展和RNA转录过程中具有重要的调控作用，在肿瘤样本中已经证实Cdk7有异常表达，同时，小分子非特异性Cdks抑制剂在临床前和临床试验中均显示了较强的抗肿瘤作用，因此推测在抗肿瘤药物研发中Cdk7可能是一个潜在的靶点。本研究用反义技术特异性沉默Cdk7基因，观察基因沉默对人肝细胞癌HepG2细胞增殖的影响，以确定Cdk7作为抗肿瘤药物研发靶点的可行性，同时也为开发反义药物筛选先导化合物。 方法：利用RNAstructure3.7 RNA结构模拟软件对人Cdk7mRNA进行二级结构模拟，根据模拟结构中突环、膨胀环、夹角、假结等单链结构选择反义序列，再经同源性分析，剔除其中与体内其它重要基因有同源性的片段，用体外培养HepG2细胞评估所选反义寡脱氧核苷酸片段的抗增殖活性，选择抗增殖作用最强的片段进行结构改造后再次用体外培养细胞评估反义寡脱氧核苷酸片段的抗增殖活性，作用最强的ASODN片段即为目的片段。 分别以DNA梯形条带形成实验、透射电子显微镜观察和流式细胞术考察细胞转染ASODN后DNA降解情况、凋亡细胞的超微结构特征和细胞凋亡比例以及细胞周期阻滞情况，确定细胞转染ASODN后通过何种途径引起生长抑制。以RT-PCR技术检测转染ASODN对细胞内Cdk7 mRNA水平的影响。以免疫印迹技术检测转染Cdk7 ASODN后对细胞内Cdk7蛋白水平的影响以及对细胞内视网膜纤维母细胞瘤蛋白(pRb)和Cdk2激酶蛋白磷酸化的影响。 结果：根据计算机模拟的人Cdk7 mRNA二级结构选择反义片第一军医大学博士研究生学位论文段，经oligowalk程序剔除可在片段内形成自身二级结构的AsoDN片段，再经同源性分析去除其中与体内重要基因有同源性的片段，最后获得21条符合实验要求的AsODN，用体外培养的HePGZ细胞筛选其抗增殖作用，结果显示互补于人cdk7 mRNA第284一303位的ASODN片段作用最强。以此序列为母体，可由其互补序列相邻上、下游各5个碱基范围区域的互补序列再次获得10条AsoDN片段，经全部磷酸骨架硫代修饰后，以体外抗增殖作用再次筛选，显示互补于Cdk7 mRNA第287~306位的ASODN抗增殖活性最强，其最大抗增殖作用为68.3士2.6%，半数抑制浓度为51.9土8 .6nmol/L。 DNA梯形条带形成实验显示，HePGZ细胞转染50、100、200、400nmol几ASODN 72h后，转染200和400 nmol几ASODN的细胞中提取的DNA进行凝胶电泳可形成明显的梯形条带;用200nlnol/L浓度ASODN转染细胞后36h提取DNA进行凝胶电泳开始出现不明显的梯形条带，48h时梯形条带明显。透射电子显微镜对转染ASODN细胞的超微结构进行观察显示，在转染浓度为100、200、40Oluno讥ASODN细胞中，视野内多见凋亡细胞，主要特征为染色质聚集，电子密度增高，细胞质内出现空泡以及脂膜包裹的颗粒等现象。用Zoonmol几ASODN转染细胞后，48h出现较多凋亡细胞，72h更为明显。流式细胞术分析显示转染200 Iunol几As0DN后，细胞凋亡比例在48h突然增加，0一36h基本无凋亡，细胞周期分析显示，S、GZ/M期细胞比例随转染时间延长逐渐下降，而GO/GI期细胞比例逐渐增加，最高比例可达到70%以上，显示出明显的GO/GI期阻滞。用不同浓度ASODN转染细胞72h，分析显示在浓度>l 00 tnnoFL，凋亡细胞比例明显增加;S、GZ佩期细胞比例随浓第一军医大学博士研究生论文度增加逐渐下降，GO/GI期细胞所占比例则明显增加，超过80%，显示细胞周期明显阻滞于GO/GI期。 通过RT一PCR和免疫印迹对Cdk7 mRNA和蛋白水平进行检测，结果显示细胞用浓度为50、100、200、400 nmol几^SOnN转染72h，其mRNA水平分别相当于转染正义ODN对照组的48.3士6.2%、50.2士6.8%、21.3士3.3%和9.7士2.8%，蛋白水平分别为对照组的0.64土0.16、0.43士0.08、0.18士0.03和0.12士0.05;以浓度200 nmol几ASODN转染细胞12、24、48和72h，Cdk7蛋白水平分别为oh对照组水平的0.48士0.06、0.33士0.04、0 .20士0.03和0.14士0.05。 将细胞用浓度为50、100、200、400 tunol几ASODN转染72h后，对pRb蛋白和CdkZ激酶的磷酸化水平进行分析，结果显示pRb磷酸化水平分别为正义对照组的0.62士0.14、0.33士0.06、0.27士0.09、0.20士0.08;CdkZ磷酸化水平为正义对照组的0 .87士0.22、0.38士0.09、0.18士0.06和0.18士0.07;用200 nrnol几AsoDN转染细胞12、24、45和72h后，pRb蛋白磷酸化水平分别为对照组的0.52士0.08、0.48士0.09、0.35士0.06和0.28士0.05，CdkZ激酶磷酸化水平为对照组的0.82士0.14、0.56士0.09、0.32士0.06和0.37士0.08，oh处理组与正义对照组无显著差异。 结论:由于Cdk7对细胞周期进展和RNA转录两条途径均有重要的调控作用，Cdk7在肿瘤组织中有异常高表达，利用反义技术特异性沉默cdk7对体外培养的人肝细胞癌HePGZ细胞可产生显著的抗增殖作用，因此认为Cdk7可作为抗肿瘤药物研发的新靶点。研究显示ASODN沉默Cdk7基因后通过下述途径产生抗增殖作用:第一军医大学博士研究生学位论文cdk4、cdk6通过催化pRb蛋白磷酸化调控细胞Gl早期进展，cdkZ催化Gl晚期进展，沉默cdk7可下调pRb蛋白和CdkZ激酶的磷酸化