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呼吸窘迫综合征是一种严重危害人类健康的原发性或继发性疾病,主要病因是肺表面活性物质(PS)的缺乏或者功能不足。PS替代治疗是唯一有效的治疗手段,目前临床所使用的PS主要为动物肺组织和人羊水提取物,但是制备比较困难,产品价格昂贵,不能满足临床的迫切需要,因此人工合成磷脂和肺表面活性相关蛋白质基因工程产物生产PS将是获得大量PS的理想途径。肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)在调节磷脂代谢、调控其它相关蛋白质基因表达、发挥内在免疫方面具有极其重要的功能。人SP-A基因定位于染色体10q21-24,由两个功能基因SP-A1、SP-A2和一个假基因组成,两种基因产物有97%的同源性。人SP-A(hSP-A)属糖结合蛋白家族,主要由Ⅱ型上皮细胞合成。SP-A单体由248氨基酸组成,相对分子质量约26~38kDa。本研究将正常中国人SP-A1基因克隆至多种表达系统并获得高效表达。 将hSP-A1基因克隆到原核表达载体pGEX-2T,转化至E.coliJM101、JM105、JM109、XL1-blue和BL21(DE3)等不同宿主中表达,经IPTG诱导后目的蛋白质GST/SP-A1的表达量为6-15%,于28℃时,该基因在BL21(DE3)宿主中表达产物均为完整蛋白质(52kDa),表达产物占总蛋白质10%,而其它宿主中均有不完全蛋白质(41kDa)表达。经包涵体纯化和GST-Purification Kit纯化得到52kDa的融合蛋白质,纯度为95%,Thrombin酶切后可得到26kDa的SP-A1,两者均能被抗-SP-A的多克隆抗体识别,具有较好的免疫反应性。GST/SP-A1免疫兔和小鼠获得的多克隆抗体能识别天然的SP-A。 重组pVT105U/α-SP-A1转化Saccharomyces cerevisiae S-78,在酵母普通培养基及营养丰富培养基中表达出相对分子质量分别为62kDa和32kDa的蛋白质,表达量约200mg/L,经Sephadex G-25层析柱分批脱盐和 Sepharose 4B层析,纯度达到 95%,目的蛋白质可被兔抗人-SP-A多克隆抗体和鼠抗人-SP-A单克隆抗体特异性识别,体外杀伤实验表明SP-AI 能增加肺巨噬细胞对E.COIi的吞噬和清除功能。 将人SP-AI基因克隆至酵母分泌表达载体PPICg,转化至甲醇营养酵母 Pichia pastoris,得到大量表型是His”Mut“(A0xl+A0xZ“)的重组菌株和少量表型为 HIS”MSt’M-AOXZO的重组体,以甲醇诱导AOXI 启动子高效表达的SP-AI,表达量约为400mg/L,用SephadexG-25层析脱盐和Sepharose 4B层析得到相对分子质量约32kDa的目的蛋白质,具有调理肺巨噬细胞对病原体的吞噬作用。 综上所述,SP-AI在大肠杆菌、S。CChs。OWC。S C。”””‘S“”S-78、Pichia P。storis中获得表达,酵母表达产物具有调理肺巨噬细胞吞噬病原体的活性,后者的表达产物活性更高,且可高密度发酵诱导表达。