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AM真菌与植物根系间形成的共生体能提高植物对土传病原物的抗性已经得到广泛共识。一些植物-AM真菌-土传病原物间的相互作用试验结果证实了AM真菌的生物防治作用，尤其在植物受到病原物侵染前预先菌根化的作用效果更为明显。然而涉及其抗病机制的研究不多。本研究分别以感南方根结线虫3号生理小种和大豆胞囊线虫4号生理小种的‘双优’山葡萄及‘鲁豆4’大豆品种为试材，对AM真菌诱导植物抗／耐线虫病害作用机制，以及AM真菌诱导的系统抗性(ISR)产生过程中是否伴随着PR蛋白基因的表达、何种信号物质直接作用于ISR信号传导途径中PR蛋白基因等问题进行了系统研究，主要结果如下： 1．采用常规方法对接种AM真菌和／或线虫的植物根中AM真菌侵染率、线虫侵染速率、POD、PAL、几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶活性进行了分析，结果表明，接种南方根结线虫(RKN，Meloidogyne incognita) 3号生理小种及大豆胞囊线虫(SCN，Heterodera glycines)4号生理小种对AM真菌Glomus．versiforme及G．fasiculatum的侵染率均未产生显著影响，但接种AM真菌却使这两种线虫的侵染速率显著下降。AM真菌均诱导了山葡萄及大豆植株根系中POD、PAL、几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶活性的提高。并且无论对于山葡萄还是大豆植株，先接种AM真菌后接种植物病原线虫的处理其根系中的POD、PAL及几丁质酶活性峰值均出现在AM真菌侵染率快速增加及植物病原线虫侵染速率快速下降时期，因而这三种酶在AM真菌诱导的抗／耐线虫病害机制中起重要作用，其中几丁质酶的作用更为突出，而β-1，3-葡聚糖酶的作用效果不明显。 2．利用Northern杂交及相对定量RT-PCR(RQRT-PCR)技术分析了接种AM真菌和/或线虫后植物根系中PAL5基因、几丁质酶Chib1及VCH3基因mRNA的表达量，结果发现AM真菌在转录水平上调控PAL5基因和PR蛋白(几丁质酶)基因Chib1及VCH3等防卫基因的表达，即接种AM真菌和／或线虫后植物根系中PAL5基因、几丁质酶基因Chib1及VCH3 mRNA的表达丰度与它们各自的酶活性变化动态基本一致，同时也说明AM真菌诱导的抗／耐线虫病害的ISR产生过程中伴随着PR蛋白基因的表达；而且AM真菌增强了防卫基因在抗线虫病害过程中的表达强度，即先接种AM真菌后接种线虫的处理，以上三种基因的表达量均高于只2 李海燕：丛技菌根（AM）真菌诱导植物方U耐线虫病害机制的研究接种线虫的处理，因而AM真菌对防御反应的启动使植物根系对第二次侵染（线虫）产生高强度的防卫反应，提高了植物对线虫的抗性。 3．通过毛细管电泳分析了接种AM真菌和／或南方根结线虫后山葡萄根中的水杨酸（SA）含量，结果显示接种AM真菌使SA含量比对照提高10倍左右，而且在每一个测试的时间点上，先接种AM真菌后接种南方根结线虫的处理其根中SA含量均最高，为对照的 10．16倍。此外，SA的含量高峰期（接种线虫后第 1天）提前于几丁质酶活性及几丁质酶基因VCH3 mRNA表达高峰期（接种线虫后第3天），因而初步认为SA参与了AM真菌诱导的掀耐线虫病害的ISR信号传导途径。 4．利用接头PCR技术首次分离到了AM真菌诱导表达的山葡萄几丁质酶基因VCH3上游启动子序列（基因银行登录号AF44ll23），并用引物延伸方法鉴定了该启动子的转录起始位点。序列分析结果表明，该启动子序列内部包含具有真核生物启动子特征的 CAAT和 TATA盒，分别位于转录起始位点上游．122和．29处：在转录起始位点上游－1181和－293处均各有一个SA顺式作用元件TGACG，初步证实SA作为信号物质参与了AM真菌诱导的抗／耐线虫病害的ISR信号传导途径。 5．采用PCR方法对VCH3启动于进行了系列片段缺失，利用农杆菌介导叶盘转化法对构建的缺失片段：：GUS嵌合基因转化了烟草NC89，并对接种AM真菌和 SA处理后的转基因烟草进行了 GUS活性的荧光检测，结果表明 AM真菌和 SA虽然对最长的启动子片段（－11 87－＋刀驱动的 GUS酶的诱导特性不同（分别为大约 2．0倍及 1刁倍于次长的启动子片段驱动的 GUS酶活性），但对转 W（－276）GUS、VCH3（－589）GUS和 VCH（－892）GUS嵌合基因的烟草根系中的 GUS酶活性均具有相似的诱导特性（图45），并且无论对于接种AM真菌还是SA处理，GUS活性的最大量表达均需要两个SA顺式作用元件的协同作用，即SA顺式作用元件对SA和AM真菌均有应答效应。因此，在AM真菌诱导的PR蛋白（几丁质酶）基因启动子中，SA顺式作用元件对SA和AM真菌相似的应答效应进一步证明SA作为重要的信号物质参与了AM真菌诱导的BR信号传导途径。 6．通过对接种AM真菌和SA处理后的转基因烟草根系进行的GUS活性组织化学分祈，结果发现，SA处理的转基因烟草根系，无论是横切面还是纵切面，GUS活性在维管组织中表达最强，在外皮层及内皮层组织中表达较弱；而AM真菌诱导的GUS活性在外皮层及内皮层稍强于或相当于在维管组织表达的程度，这 山东农业大学博士学位论文3与AM真菌的侵染特性一致（它只侵染寄主植物的皮层及内皮层组织），因而AM真菌首先在外皮层及内皮层组织中诱导?