【摘 要】
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落叶松是松科落叶松属的一种针叶树,是我国常用商品木材和人工造林树种。落叶松的育种周期长,定向改良难度高,而基因工程育种又缺乏稳定、可靠、有效的再生系统。因此,本研究以针叶为起始外植体,开展了长白落叶松高效离体再生系统与遗传转化体系研究,首次建立以针叶为起始外植体的落叶松离体再生系统,并开展了落叶松针叶遗传转化体系研究,为落叶松基因工程育种、基因编辑及优质种苗繁育提供了一整套全新的技术体系。在离体再
【基金项目】
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国家科技重大专项“转基因落叶松新品种的培育”（2018ZX08020-003）；
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落叶松是松科落叶松属的一种针叶树,是我国常用商品木材和人工造林树种。落叶松的育种周期长,定向改良难度高,而基因工程育种又缺乏稳定、可靠、有效的再生系统。因此,本研究以针叶为起始外植体,开展了长白落叶松高效离体再生系统与遗传转化体系研究,首次建立以针叶为起始外植体的落叶松离体再生系统,并开展了落叶松针叶遗传转化体系研究,为落叶松基因工程育种、基因编辑及优质种苗繁育提供了一整套全新的技术体系。在离体再生阶段研究了影响落叶松针叶离体再生的诸多因素,建立了高效的落叶松针叶离体再生系统。实验结果如下:1)外植体制备的最佳消毒方案为75%酒精30s+0.1%升汞4min;2)DCR+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA为针叶直接不定芽诱导的较佳配方,直接不定芽诱导率为66.33%,平均芽数80个/外植体;3)MS+0.3 mg/L 6-BA+3 mg/L NAA为最佳的愈伤组织诱导配方,愈伤诱导率达到92.03%;4)DCR+1mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA为合适的间接不定芽诱导配方,不定芽诱导率达77.31%,不定芽数306个/外植体;5)伸长分为两个步骤进行,DCR+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA为较佳的一步伸长配方,DCR+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+2 g/L AC为较佳的二步伸长配方,不定芽伸长率可达到60.04%,平均芽苗长度为2.5cm;5)DCR+3 mg/L IBA+0.02 mg/L烯效唑为较合适的生根配方,生根率达53.33%,移栽成活率达87.48%。以长白落叶松针叶愈伤为受体材料,研究了影响落叶松针叶遗传转化效率的各种因素,并初步建立了落叶松针叶遗传转化体系。结果发现:300 mg/L的Cef（头孢霉素）为落叶松针叶遗传转化中较合适的抑菌剂;侵染与共培阶段均添加200μmol/L乙酰丁香酮能显著提高转化效率;适宜的菌液浓度(OD600为0.4)、侵染时间（20 min）、共培养时间（2 d）等均能有效提高抗性愈伤率;采用分步筛选方案能有效提高抗性芽的诱导率与存活率。应用该遗传转化体系,对落叶松针叶进行遗传转化实验,可获得一定数量的抗性不定芽,PCR检测与试纸条检测表面外源Bt基因已成功整合到落叶松基因组,并产生了Bt蛋白。
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