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大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国重要的海水养殖鱼类,以体色金黄而出名。金黄的体色已经成为其重要的经济性状,与大黄鱼的价格息息相关。大黄鱼的金黄体色源自其体表的黄色素细胞。有趣的是,大黄鱼存在“见”光变白的现象。白天或灯光照射下,大黄鱼的金黄体色在2-3 min内快速变成银白色;而到了晚上或黑暗环境,则呈现金黄色。本课题组近年来的研究表明,大黄鱼体色呈现金黄,主要依赖于黑色素细胞刺激素(melanocyte-stimulating hormone,MSH)作用于黄色素细胞的MC5R受体,进而引起胞内色素颗粒扩散;而体色变银白,则是由于光线中的特定波长激发黄色素细胞的光受体,引起胞内色素颗粒收缩。色素细胞内色素颗粒的收缩与扩散依赖于细胞内的运输系统。目前对黑色素细胞内黑素体运输过程的研究表明,该过程主要与基于微管和微丝(亦称为肌动蛋白丝)的运输系统有关。在这一系统中,微管和微丝主要发挥轨道的功能,而运输过程的动力来源于马达蛋白,如与微管结合的驱动蛋白(kinesin)和动力蛋白(dynein),以及与微丝结合的肌球蛋白(myosin)。为了进一步阐明大黄鱼黄色素细胞内色素颗粒运输的分子机制,本研究以大黄鱼腹部鳞片上的黄色素细胞为主要研究对象,结合特异性药物处理和形态学观察的方法,研究微管和微丝及其马达蛋白在黄色素细胞色素颗粒移动过程中的所发挥的功能。所取得的研究结果如下:1.扩散的黄色素细胞经微管特异性解聚剂Nocodazole(1μM)处理12 h后,光照无法引起其胞内色素颗粒的收缩;完全收缩的黄色素细胞经Nocodazole(1μM)处理后,在光照下无法保持其完全收缩状态,且处理5 min左右就可出现扩散现象。相反,扩散的黄色素细胞经微丝特异性解聚剂Latrunculin A(1μM)处理12 h后,光照仍然能够引起色素颗粒收缩;Latrunculin A(1μM)处理黄色素细胞也不影响其保持完全收缩状态。此外,黄色素细胞经Latrunculin A(1μM)处理后,外源MSH(1μM,30 min)虽能激发色素颗粒扩散,但其扩散程度显著低于未经Latrunculin A处理的对照组(p<0.05)。Latrunculin A(1μM)与 Nocodazole(1μM)联合处理黄色素细胞后,外源MSH(1 μM,30 min)诱导的色素颗粒扩散程度显著低于仅经Latrunculin A(1μM)预处理的黄色素细胞的扩散程度(p<0.05)。上述结果说明,黄色素细胞内色素颗粒的收缩过程依赖于微管,而扩散过程与微管和微丝均有关联。2.黄色素细胞的收缩依赖于微管,而微管上起到向心运输的马达蛋白主要是dynein。为验证dynein是否在大黄鱼黄色素细胞收缩中发挥作用,我们使用dynein抑制剂正钒酸钠(Sodium Orthovanadate)对黄色素细胞进行药物处理。我们发现,正钒酸钠对光照引起的黄色素细胞的收缩具有抑制作用,且其抑制效应具有时间依赖性和剂量依赖性。扩散的黄色素细胞经100μM正钒酸钠处理30min后,光照引起了 71.77±1.61%的黄色素细胞的收缩;而延长处理时间至60 min后,仅有25.20±1.27%的黄色素细胞能够收缩。扩散的黄色素细胞经不同浓度(1000 μM、100 μM、50 μM)的正钒酸钠避光处理60 min后,也不同程度抑制了光照引起的收缩作用,1000μM处理组几乎完全抑制了光照引起的黄色素细胞的收缩。此外,dynein具有维持黄色素细胞完全收缩形态的重要作用。初始状态为完全收缩的黄色素细胞,经不同浓度正钒酸钠(0,50,100和1000μM)光照处理60 min后,与对照组相比(0μM),处理组黄色素细胞改变其收缩状态的比例显著增加,1000 μM处理组几乎抑制了所有的黄色素细胞收缩(95.61±1.23%),100 μM 和 50 μM 分别抑制了 43.83±10.04%和23.68±2.17%的黄色素细胞收缩。上述结果表明,dynein参与了黄色素细胞内色素颗粒的收缩过程。3.我们课题组的前期研究表明,黄色素细胞内色素颗粒的收缩过程与Ca2+相关的信号通路有关。因此,我们进一步研究了 Ca2+的下游信号蛋白激酶C(PKC)是否参与了黄色素细胞的收缩。我们使用一种PKC的激活剂PMA对黄色素细胞进行药物处理。避光条件下,扩散的黄色素细胞经PMA(0、1、10、100 μM)避光预处理1h后,10 μM PMA处理组的黄色素细胞呈现半收缩状,100 μMPMA处理组的黄色素细胞则完全收缩。上述结果表明,黄色素细胞的收缩与PKC的激活有关。我们的研究表明,微管及其结合的马达蛋白dynein和依赖于Ca2+的PKC均参与了黄色素细胞的收缩。我们进一步研究了 dynien与PKC之间是否存在潜在关联。在避光条件下,我们首先使用Latrunculin A(1μM,12 h)处理黄色素细胞以解聚其胞内的微丝。随后使用PKC抑制剂Sotrastaurin(10 μM)继续避光处理2h,再进行光照刺激。我们发现,黄色素细胞无论是否解聚微丝,Sotrastaurin(10μM)处理均会抑制黄色素细胞的收缩。此外我们还发现,黄色素细胞经dynein抑制剂正钒酸钠(1000μM)处理1h后,PKC激活剂PMA(100μM,1h)无法引起黄色素细胞收缩。这一结果说明,PKC是dynein的上游调控因子。4.我们课题组前期研究表明,升高胞内cAMP的水平,可引起色素颗粒扩散,但还未探究黄色素细胞的收缩是否依赖于cAMP水平降低。我们使用特异性水解cAMP的磷酸二酯酶(PDE4)的抑制剂茶碱进行活体和体外实验研究。我们发现,大黄鱼活体经10 mM茶碱避光浸泡30 min后,光照10 min也无法使其腹部完全变白。体外实验中,与对照组相比(0 mM),茶碱处理组(0.1、1、10 mM)黄色素细胞的收缩比例显著降低,且收缩的比例随茶碱浓度的升高而降低,10mM抑制效果最显著(p<0.05),可使黄色素细胞收缩比例降低至23.04±2.12%。这一结果说明,黄色素细胞的收缩依赖于胞内cAMP水平降低。综述所述,微丝和微管均参与了大黄鱼黄色素细胞的扩散,且微丝上的扩散力强于微管上的扩散力;光照引起的黄色素细胞色素颗粒的收缩依赖于微管,而不依赖于微丝;微管上负责向心运动的马达蛋白dynein参与了色素颗粒的收缩过程;细胞内的Ca2+-PKC信号通路参与了色素颗粒的收缩,且dynein是该通路的下游调控因子;同时,色素颗粒的收缩还依赖于细胞内cAMP水平的降低。本研究对于揭示大黄鱼黄色素细胞内色素颗粒移动的分子机制具有一定的意义。