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本研究前期的实验证明通过贴壁法分离得到BMSCs在肝损伤刺激物的诱导下可以向肝细胞方向分化。但是,BMSCs向肝细胞方向诱导分化的周期比较长,一般需要21天,这样对于临床肝细胞移植所需要的细胞数量是一个很大的限制。同时大量的研究表明许多信号通路都参与了BMSCs定向分化的调控,但是有那些信号通路参与了BMSCs向肝细胞的诱导分化呢?我们又怎样来调控这些经典的信号通路中各个因子的变化从而实现BMSCs的快速分化呢?如果我们能解决这些最基本的问题,对于干细胞在以后的临床应用将是非常有意义的。
方法:
1、利用贴壁法分离培养原代大鼠BMSCs,优化骨髓间质干细胞的传代培养条件,并通过流式细胞技术对骨髓间质干细胞的表型特征进行鉴定。
2、采用2-AAF/CCl4急性肝损伤模型SD大鼠肝组织匀浆诱导骨髓间质干细胞,RT-PCR检测BST-1、GST-P、M2-PK及Albumin mRNA的表达。
3、采用反向点杂交技术检测Wnt,Notch,TGF-β和Jak-stat等四条信号通路各个关键基因在BMSCs向肝细胞分化过程不同时间点的表达谱,以探讨Wnt/Notch/TGF-β/Jak-stat在BMSCs肝向分化过程中的作用。
4、DKK1阻断Wnt信号通路,并用MTT检测其对BMSCs增殖的影响,Western-blot技术鉴定DKK1对Wnt信号通路的阻断效果,RT-PCR检测BST-1、GST-P、M2-PK及Albumin mRNA的表达,探讨下调Wnt信号通路对BMSCs肝向分化的作用。
5、加入Wntl至诱导培养液中,RT-PCR检测BST-1、GST-P、M2-PK及Albumin mRNA的表达,探讨上调Wnt信号通路对BMSCs肝向分化的作用。
结论:
1.我们分离的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点,不是造血类的细胞,随着细胞传代的进行,其表型特征稳定。
2.骨髓间质干细胞肝向分化过程中Wnt信号通路明显的被下调,这表明Wnt信号通路的下调可能有助于BMSCs的干向分化。
3.骨髓间质干细胞肝向分化过程中Notch信号通路明显的被下调,这表明Notch信号通路的下调可能有助于BMSCs的干向分化。
4.骨髓间质干细胞肝向分化过程中TGF-β信号通路各基因的表达趋势不规则,这也许与TGF-β1,TGF-β 2和TGF-β 3的多种生物学功能有关的,也许其在BMSCs肝向分化过程中并没有扮演很重要的角色。
5.骨髓间质干细胞肝向分化过程中Jak-stat信号通路各基因的表达趋势不规则,但是其表达水平在BMSCs分化前都很高,这也许对维持BMSCs的高增殖性有重要作用。
6.我们发现随着DKK1阻断时间的延长,β-catenin的蛋白表达水平逐渐降低,至第24天细胞浆中β-catenin蛋白水平降至最低,这表明DKK1可以显著下调Wnt信号通路。
7.Wnt信号的下调可以促进骨髓间质干细胞向肝细胞分化;而Wnt信号的上调可以抑制骨髓间质干细胞向肝细胞分化,使骨髓间质干细胞保持未分化状态。