论文部分内容阅读
研究背景及目的：急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一种起源于T系淋巴祖细胞的侵袭性血液系统疾病。T-ALL表现为骨髓中未成熟T淋巴细胞弥漫性浸润、高白细胞比例、纵膈肿大以及中枢神经系统受累等特征,其幼稚细胞可以侵犯骨髓外组织,如脑膜、胸腺、性腺、肝、肺、脾及淋巴结等,引起相应病变。其恶性增殖和侵袭程度与患者的预后密切相关。随着高效治疗手段的应用,儿童患者的治愈率已经达到70%。但是,与儿童患者相比,成人患者的预后较差。趋化因子受体9(CC chemokine receptor 9, CCR9)是高表达在T-ALL中的一种趋化因子受体,CCR9与其唯一配体CC型趋化因子25(C-C motif chemokine ligand 25, CCL25)结合后能够显著增强白血病细胞的浸润。Wnt家族是一类含有丰富半胱氨酸的分泌性糖蛋白,参与肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。Wnt与趋化因子/趋化因子受体关系密切,有研究表明：趋化因子可促进特定Wnt分子的表达；另有报道显示某些Wnt分子参与趋化因子介导的细胞侵袭转移。我们实验室前期研究发现CCL25/CCR9通路介导T-ALL细胞系MOLT4细胞的转移,然而在T-ALL中有关CCL25/CCR9与Wnt家族的关系尚未见报道。本课题旨在探讨成人T-ALL中,CCL25/CCR9与Wnt家族的关系,寻找CCL25/CCR9调控的关键Wnt成员,为阐明CCL25/CCR9介导的成人T-ALL转移(浸润)提供理论依据,为成人T-ALL的治疗提供新的潜在治疗靶标。研究内容和方法：以高表达CCR9的成人T-ALL细胞系MOLT4细胞为研究对象,RT-PCR检测CCL25对MOLT4细胞所有Wnt成员表达的影响,筛选出变化最明显的Wnt成员；实时定量PCR和Western Blot验证CCL25对MOLT4细胞Wnt5a表达的影响；Western Blot检测PKC在CCL25诱导MOLT4细胞Wnt5a表达过程中的作用。以阐明CCL25对MOLT4细胞Wnt5a表达的影响及调控分子机制。GSEA (Gene Set Enrichment Analysis)分析Wnt5a在成人T-ALL中可能参与的生物学过程；Western Blot、Trans well和Matrigel-Transwell检测Wnt5a对MOLT4细胞迁移和侵袭能力的影响,以及抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA对Wnt5a诱导的MOLT4细胞迁移和侵袭的影响；激光共聚焦显微镜和扫描电镜分别检测Wnt5a对MOLT4细胞极化和细胞伪足形成的影响,以及抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA对Wnt5a诱导的MOLT4细胞极化和细胞伪足形成的影响。以阐明Wnt5a对MOLT4迁移和侵袭能力的影响及其调控机制。Transwell和Matrigel-Transwell检测Wnt5a对CCL25介导的MOLT4细胞迁移和侵袭的影响；MOLT4细胞SCID小鼠体内移植实验检测Wnt5a对CCL25介导的MOLT4细胞转移(浸润)的影响；Western Blot检测Wnt5a在CCL25介导的MOLT4细胞RhoA活化过程中的作用。以阐明Wnt5a对CCL25介导的MOLT4细胞转移(浸润)的影响及分子机制。研究结果：Wnt家族中仅Wnt2b, Wnt5a和Wnt10b在MOLT4细胞中有明显表达,而其他15个Wnt成员几乎不表达,其中Wnt5a经CCL25处理后表达水平显著升高；抑制PKC后显著降低了CCL25诱导的Wnt5a表达,相反,激活PKC后Wnt5a表达显著上升。GSEA基因富集分析的结果提示Wnt5a在成人T-ALL中与多种与迁移侵袭生物学过程相关；体外迁移和侵袭实验证实Wnt5a可以促进MOLT4细胞的迁移和侵袭,抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA后显著降低Wnt5a诱导的MOLT4细胞的迁移和侵袭。激光共聚焦结果显示Wnt5a促进了MOLT4细胞极化,抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA后显著降低了Wnt5a诱导的MOLT4细胞极化。扫描电镜结果显示Wnt5a促进了MOLT4细胞片状伪足和丝状伪足形成,抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA后显著降低了Wnt5a诱导的MOLT4细胞片状伪足和丝状伪足形成。迁移和侵袭实验的结果发现干扰Wnt5a后显著降低了CCL25诱导的MOLT4细胞迁移和侵袭,相反,外源Wnt5a可显著增强CCL25诱导的MOLT4细胞迁移和侵袭。在动物模型中,实验结果显示Wnt5a处理组骨髓中MOLT4细胞比例显著低于Control组,而Wnt5a和CCL25单独或共同处理组PBMC中MOLT4细胞比例都显著低于Control组;4组MOLT4细胞异种移植小鼠的体重都显著低于Normal组,而器官体重比都显著高于Normal组;4组MOLT4细胞异种移植小鼠中只有Wnt5a+CCL25处理组的小鼠肝脏出现明显病变；H&E染色的结果显示Wnt5a处理组、CCL25处理组和Wnt5a+CCL25处理组的MOLT4细胞向肝脏浸润的水平都显著高于Control组,且Wnt5a+CCL25处理组的MOLT4细胞向肝脏浸润水平显著高于Wnt5a处理和CCL25处理组,表明Wnt5a可单独或协同CCL25促进MOLT4细胞向肝脏转移(浸润)。Western Blot结果显示Wnt5a可增强CCL25介导的MOLT4细胞RhoA的活化,提示Wnt5a可能通过协同CCL25诱导RhoA的活化参与CCL25介导的MOLT4细胞向其他器官的转移(浸润)。结论：1. CCL25/CCR9通过活化和上调PKC促进成人T-ALL细胞系MOLT4细胞Wnt5a的表达。2. Wnt5a通过PI3K/AKT-RhoA途径促进细胞发生极化和细胞伪足生成来调节成人T-ALL细胞系MOLT4细胞迁移和侵袭,Wnt5a有可能成为治疗成人T-ALL的靶点。3. Wnt5a协同CCL25诱导RhoA的活化参与CCL25介导的MOLT4细胞向其他器官转移(浸润)。