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目的: 观察缺氧/复氧条件下星形胶质细胞缝隙连接的变化以及亚低温对其变化的影响,探讨星形胶质细胞缝隙连接与脑缺血的关系以及亚低温对脑缺血的保护机制。
方法: 利用新生24小时SD大鼠脑皮质为原料,采用Manthorp连续传代法建立稳定的星形胶质细胞的体外纯化培养体系,利用倒置显微镜观察细胞生长及分化的形态学变化。以神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定星形胶质细胞,95%以上为阳性细胞,符合实验要求。采用三气培养箱分别调节温度37℃及32℃,缺氧12h后分别复氧30min、1h、2h、3h、6h成功建立了星形胶质细胞缺氧/复氧模型,分为正常对照组(C)、常温缺氧/复氧组(H/R)、亚低温干预缺氧/复氧组(M+H/R)。用台盼蓝染色法测定37℃及32℃时,缺氧/复氧不同时间点AC的存活率,作为细胞受损指标,用倒置相差显微镜对细胞进行形态学观察。应用划痕标记染料示踪技术(SLDT)在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下测定缺氧/复氧各个时间点荧光黄染料(LY)在缝隙连接间的扩散距离,以测定缝隙连接水平。应用细胞免疫荧光技术检验缺氧/复氧各个时间点星形胶质细胞缝隙连接的主要成份缝隙连接蛋白Cx43的蛋白表达水平及亚低温的干预效果,并进行蛋白表达半定量分析。
结果:
1. AC体外纯化培养后,细胞胞体较大,具有多而粗大的突起,形态不规则,轮廓较清晰。GFAP免疫细胞化学染色鉴定星形胶质细胞胞浆呈棕黄色。
2. 37℃缺氧12小时后,细胞的形态、存活力变化不明显,部分细胞边缘皱缩。复氧开始后,可见AC出现胞体增大,细胞肿胀, 轮廓不清,突触回缩,细胞损伤表现明显加强等现象,随复氧时间的延长,可见细胞碎片和漂浮细胞增多。细胞存活力下降,呈明显的时效关系。亚低温干预时大部分细胞状态较常温组好。细胞轮廓较清晰,胞周光晕明显,突起存在,仅有少数细胞出现分离现象。细胞存活力较常温缺氧/复氧组增加。
3.划痕染料示踪方法观察荧光黄染料扩散距离发现: 37℃缺氧12h,染料仍可在细胞间进行扩散,扩散距离较对照组无明显变化(P>0.05),复氧开始后染料扩散距离明显下降,于复氧2h降至最低,而后随复氧时间延长扩散距离呈逐渐增加趋势,与对照组复氧各时间点相比差异有显著性(P<0.01)。 亚低温干预缺氧/复氧时荧光染料扩散距离在各个时间点均较37℃缺氧/复氧组减少,差异有显著性 (P<0.01)。
4. 细胞免疫荧光半定量方法观察Cx43的表达发现:37℃缺氧/复氧各时间点蛋白荧光强度较对照组无明显变化(P>0.05);亚低温干预缺氧12h,Cx43荧光强度较对照组减少(P<0.01),而复氧后CX43荧光强度呈现先降低后升高趋势。在各个时间点与37℃缺氧/复氧组相比差异有显著性(P<0.01)。
结论:
1. 体外培养的星形胶质细胞对缺氧有耐受性,复氧后细胞损害随着时间延长逐渐加重。 亚低温可以减轻缺氧/复氧时星形胶质细胞的损伤。
2. 星形胶质细胞在缺氧/复氧后缝隙连接仍处于开放状态。亚低温干预时缝隙连接功能显著降低,亚低温对缝隙连接抑制作用更加明显。
3. 37℃缺氧/复氧后缝隙连接功能下降并不是缝隙连接蛋白表达水平的变化。 亚低温干预时通过降低Cx43的表达,从而达到抑制缝隙连接的作用。