论文部分内容阅读
目的:1,对正常和OA的关节软骨组织中的miR-1和Ihh的含量进行检测,验证miR-1和Ihh在骨关节炎中的重要作用。2,构建条件性过表达miR-1小鼠(Col2a1-CreERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1小鼠)并对其进行基因学验证。3,对Col2a1-CreERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1小鼠进行ACLT手术构建OA模型,证实miR-1可以延缓骨关节炎病理进程。方法:1,对正常和OA的关节软骨组织中的miR-1和Ihh的含量进行检测:（1）取人的膝关节软骨按损伤程度分为OA组和对照组,提取总RNA逆转录后使用RT-qPCR分析miR-1及Ihh在骨关节炎软骨中的表达情况。（2）取人的膝关节按损伤程度分为OA组和对照组,标本切片后使用番红固绿和免疫组化来分析Ihh在在骨关节炎软骨中的表达情况。2,Col2a1-CreERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1小鼠的基因学验证:（1）取基因小鼠与同龄野生型小鼠分别通过比较外形大小,X线,番红固绿染色来观察基因小鼠和野生小鼠就基本特性有无明显差别。（2）取基因小鼠分两组:TM组（注射他莫昔芬）和NO TM组（注射玉米油）,取膝关节软骨后提取总RNA,逆转录后通过RT-qPCR分析miR-1及Ihh的表达情况。3,MiR-1对骨关节炎病理进程的影响:取Col2a1-CreERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1转基因小鼠分4组（NO TM+ACLT,NO TM+假手术,TM+ACLT,TM+假手术）,术后两个月对小鼠进行X线成像和体内荧光分子层析成像（FMT）,同时收集小鼠组织通过免疫组化染色,RT-qPCR和番红固绿染色来分析miR-1是否能在体内通过作用于Ihh来影响骨关节炎的进展。结果:1,与OA组相比,RT-qPCR结果显示正常组中miR-1、COLⅡ和AGG水平较高,而Ihh及Ihh下游基因（如Gli2、Gli3和SMO）、MMP-13和COLⅩ表达水平较低。免疫组化结果显示相对正常组,OA组Ihh和MMP-13的表达水平较高。2,在他莫昔芬（tamoxifen）诱导前,转基因小鼠和野生型小鼠在2月龄时表型无差异,表现出相似的体型、X线外观和正常的番红固绿染色。然而,相比较于NO TM组的小鼠,TM组的小鼠Ihh、Gli2、Gli3、SMO、MMP-13和COLⅩ水平较低,但COLⅡ,AGG和miR-1的表达水平较高。3,我们利用ACLT建立了转基因骨关节炎小鼠模型。ACLT术后2个月,通过X线和番红染色,相比于NO TM+ACLT组,TM+ACLT组表现出了更小的关节损害。免疫组化显示,NO TM+ACLT组关节组织中Ihh、COLⅩ、MMP-13蛋白表达明显高于TM+ACLT组。NO TM+ACLT组关节组织COLⅡ表达低于TM+ACLT组。RT-qPCR数据显示与NO TM+ACLT组相比,TM+ACLT组关节组织中Ihh、Gli2、Gli3、SMO、MMP-13和COLⅩ表达水平较低,但COLⅡ和AGG表达水平较高;而Gli1水平无显著差别。FMT结果显示MMPs的水平显著低于TM+ACLT组（3.74±0.45 pmol）比NO TM+ACLT组（8.20±1.51 pmol;P<0.05）。TM+ACLT组组织蛋白酶水平（6.36±1.80 pmol）明显低于NO TM+ACLT组（16.18±4.42pmol;P<0.05）,进一步证明了免疫组化及RT-qPCR的结果。4,结论:我们目前的研究显示,miR-1在保护关节软骨免受骨关节炎诱导的退行性变中发挥重要作用。未来的研究将进一步研究miR-1作为预防和治疗骨关节炎的新策略,为骨关节炎的治疗提供一种新的思路和方向。