大肠癌(colorectal carcinoma)包括结肠癌与直肠癌，是常见的恶性肿瘤。近20多年来，世界上多数国家大肠癌发病率呈上升趋势，我国大肠癌发病率上升趋势亦十分明显，在上海，大肠癌的发病率以每年4.2％左右的速度上升，因此，预计我国大肠癌的发病率和死亡率还将继续上升，成为最重要的恶性肿瘤之一。目前了解到大肠癌的发生是一个多步骤、多因素进行性发展的过程，可能有癌基因被激活，抑癌基因被抑制等，但是具体的机理尚不清楚。miRNA.在细胞产生、增殖及凋亡过程中发挥特有的负性调控能力，与人类许多疾病(包括肿瘤)的发生发展密切相关。近来的研究证实miRNA确在人类肿瘤中扮演着极为重要的角色，可能是潜在的癌基因或抑癌基因。我们研究大肠癌的miRNA表达谱，并在蛋白水平研究miRNA通道Argonaute2蛋白与大肠癌的关联性，深入探讨其作用机理，为进一步通过miRNA途径预测、诊断及治疗大肠癌提供实验依据。　　 目的：　　 1.全面探讨无淋巴结转移结肠癌与癌旁黏膜组织的miRNA表达谱，筛选与结肠癌早期发生、发展相关的特异性miRNA。　　 2.挑选特异性miRNA中上调的2个miRNA即miR-18a和miR-135b进行RT-PCR验证。　　 3.严格按照组织芯片的制作流程构建包含有大肠癌组织和癌旁黏膜组织的组织芯片。　　 4.运用高通量的组织芯片技术结合免疫组化染色的方法研究大肠癌组织和癌旁黏膜组织中Argonaute2(EIF2C2)的表达及其临床意义。　　 方法：　　 1.选取手术、病理证实未发生淋巴结转移的结肠癌及对应远端相对正常组织标本，利用mirVana RNA抽提分离miRNA，与Agilent miRNA基因芯片杂交，采用Feacture Extraction软件进行图像和数据分析，应用miRNA靶基因预测数据库miGEN，我们利用miGEN输出在3个预测软件中均出现的基因为靶基因。　　 2.挑选差异表达的miRNA中的两个miRNA进行荧光定量RT-PCR的验证，miRNA的PT-PCR方法参照QIGEN-miScriptsystem中的操作步骤进行。采用U6RNA作为内标，进行归一化。结果运用QIGEN软件数据库分析。　　 3.组织芯片由生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司制备。所有供体组织蜡块行常规病理切片后做HE染色，病理专家做二次诊断，并在HE切片上根据典型病理部位作标记。显微镜下对所需穿取的目标组织进行定位，选取癌组织、癌旁组织共计360个位点。阵列制作利用组织阵列仪(ManualTissue Arrayer)在受体蜡块(空白蜡块)上打孔(直径1.0mm)，然后根据HE片上精确范围在供体组织蜡块相应位置获取所要组织芯放入受体蜡块阵列孔中，并记录组织编号，重复上述步骤制成阵列块，以5μm的厚度连续切片。所得的组织芯片的每个点都经过病理诊断。　　 4.采用Ensembl数据库及抗体设计筛查软件(Dragonfly，USA)选择Argonaute2(EIF2C2)蛋白特异的片段，并由C-Strong公司合成特异性Argonaute2(EIF2C2)多肽，以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原，通过致敏大白兔，制备兔抗人Argonaute2(EIF2C2)多克隆抗体，然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和western blot方法进行纯化抗体验证。采用免疫组织化学法检测大肠组织芯片中Argonaute2(EIF2C2)的表达，采用二步法进行免疫组化染色，严格按照试剂盒操作说明进行，DAB显色。用柠檬酸高温高压法进行抗原修复。免疫组织化学染色阳性信号为黄色到棕黄色，参照Rahman等的标准予以记分。　　 结果：　　 1.筛选出在结肠癌中差异表达的microRNA有14个，其中12个microRNA表达水平增高，分别为miR-106b、miR-135b、miR-18a、miR-18b、miR-196b、miR-19a、miR-224、miR-335、miR-424、miR-20a*、miR-301b和miR-374a；2个microRNA表达水平降低，分别为miR-378和miR-378*。根据miGEN整合数据库预测差异表达microRNA的靶基因，输出在3个软件中均出现的基因为可能的靶基因，结果发现miR-106b和miR-19a这两个microRNA下游存在符合要求的靶基因且数目众多，我们从中筛选出可能与肿瘤相关的28个基因。　　 2.采用荧光定量RT-PCR.的方法检测了表达谱中明显表达上调的miR-18a和miR-135b在3组癌组织和癌旁对照组织中的表达，并采用U6进行归一化。miRNA定量PCR扩增曲线和融解曲线，显示融解曲线均为单一峰，说明PCR扩增特异性较好。我们又将芯片结果与荧光定量RT-PCR结果进行比较，结果显示miR.18a和miR-135b在3组癌组织中表达均上调，miRNA芯片与定量RT-PCR的结果一致，说明本研究芯片结果真实可靠。　　 3.我们用以制作组织芯片的90例大肠癌组织标本中包括40例直肠癌组织标本和50例结肠癌组织标本，每1例组织标本都分别有癌组织和癌旁组织(即2组)，因此选取每1例组织标本中癌组织和癌旁组织各2点(共4个点)，共计360个位点，按照实验目的设计组织芯片阵列的组织类型和排列方式。　　 4.大肠癌组织中Argonaute2(EIF2C2)的表达显著高于正常大肠黏膜组织，差异具有显著性统计学意义(P<0.01)。Argonaute2(EIF2C2)的表达与性别、年龄、部位、分化程度、淋巴结转移和临床分期无关(P>0.05)。　　 结论：　　 1.miR-106b、miR-135b、miR-18a、miR-18b、miR-196b等miRNA在结肠癌与正常组织中存在差异表达，预测其下游靶基因中大部分与肿瘤相关，提示它们可能在结肠癌早期发生、发展过程中起着重要的调控作用。　　 2.miR-18a和miR-135b的荧光定量RT-PCR结果与miRNA芯片的结果符合，说明本研究芯片结果真实可靠。　　 3.严格按照组织芯片的制备流程构建了包含有360个位点的大肠癌组织芯片，为下面进一步的研究miRNA通路的重要通道蛋白Argonaute2在大肠癌组织中的表达及其临床意义打下了扎实的物质基础。　　 4.Argonaute2(EIF2C2)信息分子表达与大肠癌发生密切相关，有望成为早期诊断标记物。