论文部分内容阅读
研究背景和目的：糖尿病是严重危害人类健康的常见病，糖尿病易并发骨骼肌病变；然而，有关糖尿病骨骼肌病变的发生机制却不完全清楚。胰岛素(Ins)靶组织对其敏感性降低，即胰岛素抵抗(IR)不仅是2型糖尿病糖脂代谢紊乱的病理基础，近年研究表明，胰岛素抵抗也在糖尿病骨骼肌病变的发生发展中起重要作用。
骨骼肌不仅是胰岛素的重要靶组织之一，也是机体摄取利用葡萄糖的主要器官。正常生理状态下，胰岛素通过作用于骨骼肌细胞膜上相应的受体活化其酪氨酸激酶，使胰岛素受体底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化，进而使蛋白激酶B(又称Akt)磷酸化激活，从而促使葡萄糖转运体4(Glut 4)从胞浆内转位到细胞膜，增加骨骼肌对葡萄糖的摄取、利用。在糖尿病状态下，骨骼肌对胰岛素敏感性降低，使其信号通路Ins/IRS-1/Akt/Glut4转导障碍，骨骼肌摄取、利用葡萄糖受阻，细胞能代谢降低，导致骨骼肌收缩功能障碍。骨骼肌根据其代谢方式和收缩特性可分为Ⅰ型纤维(又称慢纤维)和Ⅱ型纤维(又称快纤维)，Ⅰ型纤维主要以线粒体氧化供能，与肌肉耐力运动有关，如比目鱼肌(Soleus，SOL)；Ⅱ型纤维主要以无氧酵解供能，与肌肉爆发力或冲刺运动有关，如趾长伸肌(Extensor digitorum longus，EDL)。然而，在某些生理病理因素作用下，骨骼肌Ⅰ型和Ⅱ型纤维的构成比会发生改变；最近研究发现，遗传性胰岛素抵抗病人和2型糖尿病病人股外侧肌中Ⅰ型纤维含量减少而Ⅱ型纤维含量增加；有趣的是，给予外源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物大鼠和NOS敲除小鼠的骨骼肌也出现与胰岛素抵抗和糖尿病相似的骨骼肌纤维构成改变，提示NOS抑制可能与糖尿病骨骼肌病变有关。
大量研究证明，NO是一种广泛存在组织细胞的信号分子；在骨骼肌细胞，由nNOS和eNOS催化L-精氨酸合成的生理浓度一氧化氮(NO)，不仅可扩张骨骼肌血管、增加血流量；也可改善胰岛素敏感性，增加骨骼肌对葡萄糖的摄取、利用；此外，NO还促进骨骼肌线粒体生物合成，增加能量代谢，从而加强骨骼肌收缩。体内存在一种调节NO生成的内源性机制，NO合成前体L-精氨酸的同系物非对称二甲基精氨酸已被证明为NOS内源性抑制物，可与L-精氨酸竞争性抑制NOS，一方面减少NO合成，另一方面增加超氧阴离子产生，导致氧化应激。
内源性ADMA是由蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)催化含有精氨酸残基的蛋白质甲基化，再经蛋白水解释放而来，主要由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)降解为二甲胺和胍氨酸；因此，PRMT1和DDAH是调节内源性ADMA浓度的重要因子。我室和国内外学者大量研究表明，内源性NOS抑制物ADMA升高不仅与肥胖、胰岛素抵抗等代谢综合征密切相关，也在糖尿病心血管并发症的发生发展中起重要作用；最近研究发现，老年人血中ADMA浓度与骨骼肌收缩张力和步行速度呈负相关。综上所述，依据内源性NOS抑制物ADMA蓄积与胰岛素抵抗、糖尿病及其并发症、以及老龄性骨骼肌功能降低密切相关，提出如下科研假设：糖尿病内源性ADMA蓄积可能通过促进骨骼肌胰岛素抵抗导致其收缩功能障碍。
为了验证这一假设，本课题拟在不同病程糖尿病大鼠确定内源性ADMA蓄积与糖尿病骨骼肌收缩功能障碍的关系，然后观测NO合成前体L-精氨酸和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能障碍的治疗作用及其与胰岛素抵抗和氧化应激的关系；再在灌胃给予外源性NOS抑制物L-硝基精氨酸大鼠以及内、外源性NOS抑制物孵育的正常大鼠离体骨骼肌条和培养的大鼠骨骼肌细胞，观测ADMA或L-NNA对骨骼肌收缩功能的直接损害作用及其与胰岛素抵抗和氧化应激的关系；从而确定糖尿病时内源性ADMA蓄积与骨骼肌收缩功能障碍的因果关系，并阐明内源性NOS抑制物促糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能障碍的可能机制，为临床防治糖尿病骨骼肌病变发掘新靶点和有效药物。
实验方法与设计：实验分为糖尿病大鼠、外源性NOS抑制物L-NNA大鼠、正常大鼠离体骨骼肌药物孵育实验和大鼠L6成肌细胞实验等四大部分：
1.不同时程糖尿病大鼠及其分组：分别制备8w、12w、16w糖尿病大鼠模型，12w为1型、8w和16w为2型；1型糖尿病大鼠模型制备采用一次性给雄性SD大鼠(体重220±10g)腹腔注射链脲佐菌素(STZ，50mg/kg,溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,pH4.5,i.p.)，再常规饲养12w；2型糖尿病大鼠模型制备采用先高脂饲养3w，然后加小剂量STZ(30 mg/kg, i.p.)一次性腹腔注射，再继续高脂饲养8~16w。(1)8周糖尿病大鼠实验：分为①正常对照组，②糖尿病组(DM)，③L-精氨酸治疗的糖尿病组(DM+L-Arg)，④L-精氨酸治疗的正常大鼠组(L-Arg)；(2)12周糖尿病大鼠实验：分为①正常对照组，②糖尿病组(DM)，③N-乙酰半胱氨酸治疗的糖尿病组(DM+NAC)，④N-乙酰半胱氨酸治疗的正常大鼠组(NAC)；(3)16周糖尿病大鼠实验：分为①正常对照组和②糖尿病组(DM)。药物治疗是从糖尿病造模成功后(即注射STZ后第5天)灌胃给予L-Arg(100 mg/kg)和NAC(250 mg/kg)治疗至相应时程，对照组大鼠每天灌胃等体积生理盐水。
2.外源性NOS抑制物L-NNA大鼠模型及分组：将体重为200~230g雄性SD大鼠随机分为①正常对照组，②N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)处理组，模型组大鼠每天灌胃给予50mg/kgL-NNA，对照组大鼠每天灌胃等容积生理盐水，连续16周。
模型大鼠骨骼肌收缩功能测定：以上模型饲养结束后，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，颈动脉插管取血后迅速分离大鼠比目鱼肌(SOL)和趾长伸肌(EDL)置液氮快速冷冻后移至-80?C低温冰箱保存用于蛋白表达和生化测定；再分离大鼠另一条腿的SOL和EDL置于盛有10mlKrebs-Henseleit缓冲液并持续充以95%O2和5%CO2混合气体的器官浴槽，用两个不锈钢钩将肌条一端固定于浴槽，另一端连接张力换能器和生理信号记录仪，并将肌条中段处于电极刺激环中央，用电刺激法测定骨骼肌单次收缩和强直收缩的最大张力以反映骨骼肌收缩功能。
3.正常大鼠离体骨骼肌药物孵育实验及分组：麻醉下迅速分离正常SD大鼠的SOL和EDL，固定于器官浴槽，平衡后测定药物孵育前的肌肉收缩张力；然后分别进行以下药物孵育实验，再测定药物孵育后骨骼肌收的最大张力，并分别比较不同药物对SOL&EDL单次收缩和强直收缩最大张力的影响。(1)内外源性NOS抑制物的量效研究：在药物孵育前测定骨骼肌第一次收缩张力，然后平衡10min，再分别用不同浓度(10、30、100μM)ADMA或L-NNA孵育SOL和EDL40min，以确定ADMA和L-NNA的最佳剂量；(2)内外源性NOS抑制物的时效研究：将骨骼肌先分别平衡40、20、0min，再分别加入30μM的ADMA或L-NNA孵育SOL和EDL20、40和60min；以确定ADMA和L-NNA作用的最佳孵育时间；(3)药物对L-NNA引起骨骼肌收缩功能抑制的影响：实验分为①正常对照组：两次骨骼肌收缩功能测定之间平衡50min；②L-NNA损伤组：在检测第一次骨骼肌单次收缩和强直收缩后，先平衡10min，再加30μM的L-NNA孵育40min；③L-NNA+药物治疗组：在第一次收缩后，先分别加入NO合成前体L-精氨酸(L-Arg, 0.5 mM)或NO供体硝普钠(SNP,10μM)、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC,50μM)或吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,30μM)孵育骨骼肌10min，再加入30μM的L-NNA共孵育40min；④药物对照组：在第一次收缩后，分别加入相应药物单独孵育骨骼肌50min；孵育结束后，再检测各组骨骼肌的第二次单次收缩和强直收缩，以评价药物对外源性NOS抑制物L-NNA引起骨骼肌收缩功能抑制的影响。
4.大鼠骨骼肌L6细胞实验和分组：接种大鼠L6骨骼肌细胞于6孔板，培养至70%融合时分组处理如下：①正常对照组、②高糖损伤组(Glu)、③ADMA损伤组、④L-Arg+Glu组、⑤L-Arg+ADMA组、⑥L-Arg对照组、⑦NAC+Glu组、⑧NAC+ADMA组、⑨NAC对照组；正常对照组不加任何药物培养50h，高糖和ADMA组先常规培养2h再分别加入30mM葡萄糖或30?M的ADMA孵育48h，药物治疗组先加入3mM的L-Arg或10μM的NAC预孵育细胞2h，再加入30mM葡萄糖或30μM的ADMA共孵育48h；药物对照组加入3mM的L-Arg或10μM的NAC单独孵育细胞50h，然后收集细胞检测胰岛素信号通路蛋白表达以反映胰岛素抵抗。
5.蛋白表达和生化指标测定：用Westernboltting检测骨骼肌组织ADMA合成酶PRMT1、代谢酶DDAH和NOS以及胰岛素信号通路的磷酸化IRS-1和总IRS-1、磷酸化Akt和总Akt、胞膜Glut4和胞浆Glut4等蛋白表达；用高效液色谱测定血清ADMA浓度，ELISA测定骨骼肌ADMA含量和血请胰岛素水平，用比色法测定骨骼肌NO含量、NOS和DDAH活性；用萤火虫荧光素酶法测定骨骼肌ATP含量，还检测骨骼肌抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量以反映氧化应激。
实验结果：1.糖尿病大鼠实验结果：①模型鉴定：与正常对照组比较，8~16w糖尿病大鼠空腹血糖均明显升高(P＜0.05~P＜0.01)，口服糖耐量试验(OGTT)各时间点血糖浓度也显著升高，血糖曲线下面积(AUC)增加(P＜0.01)；用ELISA测得8w-和16w-2型糖尿病大鼠血浆胰岛素水平明显高于正常对照组，而12w-1型糖尿病大鼠血浆胰岛素浓度则低于正常对照组(P＜0.01,Tab.1)；这些结果表明糖尿病大鼠模型成功建立(Fig.1)。②骨骼肌收缩功能：8~16w糖尿病大鼠SOL单次收缩(P＜0.05~P＜0.01)和强直收缩以及EDL强直收缩(P＜0.01~P＜0.001)最大张力随病程增加而进行降低，在相同病程糖尿病大鼠同一肌肉强直收缩最大张力降低比单次收缩张力降低更明显(P＜0.05vsP＜0.01vsP＜0.001)，提示糖尿病大鼠SOL和EDL单次收缩和强直收缩呈病程依赖性抑制加重(Fig.2)；用NO合成前体L-Arg体内治疗8w可阻止糖尿病所致SOL和EDL收缩功能降低(P＜0.01,Fig.2A&B)，用抗氧化剂NAC体内治疗12还可翻转糖尿病所致SOL和EDL单次收缩(P＜0.001vsDM)和强直收缩(P＜0.01vsDM,Fig.2)的抑制作用，提示L-Arg和NAC对糖尿病骨骼肌收缩功能抑制有很好的治疗作用，其中NAC的治疗效果更佳。③PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路：与正常对照组比较，8~16w糖尿病大鼠血清ADMA浓度显著升高(P＜0.01,Fig.3~5A)，骨骼肌SOL和EDL组织ADMA含量明显增加(P＜0.05,Fig.3~5B)，DDAH及NOS活性抑制(P＜0.01,Fig.3~5C&D)、NO含量减少(P＜0.01,Fig.3~5E)；如图6~8所示，8~12w糖尿病大鼠SOL和EDL组织PRMT1和iNOS表达上调、而DDAH1和DDAH2以及eNOS和nNOS表达均下调(P＜0.01)，16w糖尿病大鼠骨骼肌PRMT1/DDAH/NOS通路蛋白表达趋势与8~12w糖尿病大鼠相似(P＜0.05)，提示糖尿病大鼠骨骼肌PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路紊乱；无论是用NO合成前体L-Arg体内治疗8w，还是用抗氧化剂NAC体内治疗12w，均可纠正8~16w糖尿病大鼠SOL的PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路紊乱(P＜0.01)以及改善糖尿病大鼠EDL该通路紊乱(P＜0.05)，提示L-Arg和NAC对糖尿病骨骼肌PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路紊乱有治疗作用，并且对SOL的效果更佳(Fig.3~8)。④相关性分析：用16.0SPSS统计分析软件进行直线相关分析，揭示大鼠骨骼肌ADMA含量与SOL和EDL单次收缩和强直收缩均呈负相关，提示内源性ADMA蓄积与糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能抑制密切相关。⑤胰岛素信号通路：与对照组比较，8~16w糖尿病大鼠骨骼肌IRS-1酪氨酸磷酸化和Akt蛋白磷酸化降低(P＜0.05,Fig.12~14)，Glut4膜转位减少(P＜0.01,Fig.12~14)，提示糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号转导障碍即胰岛素抵抗；用L-Arg治疗8w可改善(P＜0.05)、用NAC治疗12w可逆转(P＜0.01)糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗(Fig.12~13)。⑥ATP含量和氧化应激：与正常对照比较，8~16w糖尿病大鼠SOL和EDL的ATP含量均明显减少(P＜0.01,Fig.15A~C)，抗氧化酶Mn-SOD活性抑制(P＜0.05,Fig.16A,C,E)，脂质过氧化产物MDA含量增加(P＜0.05Fig.16B,D,F)，提示能量代谢降低、氧化应激增加；经抗氧化剂NAC治疗12w既可逆转糖尿病大鼠骨骼肌ATP含量减少(P＜0.01,Fig.15B)，又可阻止氧化应激增加(P＜0.05,Fig.16C-D)，提示抗氧化剂NAC可改善糖尿病大鼠骨骼肌线粒体代谢和氧化应激。
2.L-NNA大鼠模型结果：给正常大鼠灌胃L-NNA(50 mg/kg)16w可引起与糖尿病大鼠几乎完全相同的骨骼肌收缩功能损害(P＜0.01,Fig.17)、PRMT1/DDAH/NOS/NO通路紊乱(P＜0.05,Fig.18~19)和胰岛素信号转导障碍(P＜0.05,Fig.20)，提示NOS抑制是导致骨骼肌收缩功能障碍的重要原因。
3.正常大鼠离体骨骼肌药物孵育结果：量效和时效研究结果发现，用30?M内源性NOS抑制物ADMA和30?M外源性NOS抑制物L-NNA孵育正常大鼠离体SOL和EDL40~60min均可明显抑制其单次收缩和强直收缩(P＜0.05~P＜0.01,Fig.21~24)，但无明显的剂量依赖性；用NO合成前体L-Arg或NO供体SNP均可逆转L-NNA的抑制作用(P＜0.05,Fig.21~24)，且SNP效果更佳(P＜0.01)；抗氧化剂NAC和PDTC亦可逆转L-NNA的抑制作用(P＜0.01,Fig.26)，且PDTC效果更佳；提示NOS抑制物是导致骨骼肌收缩功能损害的直接原因。
4.大鼠骨骼肌L6细胞结果：与正常对照组比较，用30mM葡萄糖和30?M的ADMA孵育大鼠骨骼肌L6细胞48h，均可降低IRS-1酪氨酸磷酸化和Akt磷酸化，减少Glut4膜转位(P＜0.05,Fig.27)，表现出与糖尿病大鼠骨骼肌相似的胰岛素信号转导障碍或胰岛素抵抗；用NO合成前体L-Arg或抗氧化剂NAC治疗均可明显改善高糖和ADMA诱导的胰岛素抵抗(P＜0.05,Fig.27)；提示ADMA或高糖是诱导大鼠骨骼肌L6细胞胰岛素抵抗的直接因素。
实验结论：通过以上四部分研究结果，可得出如下实验结论：
1.糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能障碍与内源性NOS抑制物ADMA蓄积密切相关；
2.内、外源性NOS抑制物对大鼠骨骼肌收缩功能有直接的抑制作用；
3.内源性NOS抑制物ADMA引起糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能抑制可能与促进骨骼肌细胞胰岛素抵抗有关；
4.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和NO合成前体L-精氨酸对内源性ADMA蓄积引起糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能损害和肌细胞胰岛素抵抗均有良好的治疗效果。
骨骼肌不仅是胰岛素的重要靶组织之一，也是机体摄取利用葡萄糖的主要器官。正常生理状态下，胰岛素通过作用于骨骼肌细胞膜上相应的受体活化其酪氨酸激酶，使胰岛素受体底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化，进而使蛋白激酶B(又称Akt)磷酸化激活，从而促使葡萄糖转运体4(Glut 4)从胞浆内转位到细胞膜，增加骨骼肌对葡萄糖的摄取、利用。在糖尿病状态下，骨骼肌对胰岛素敏感性降低，使其信号通路Ins/IRS-1/Akt/Glut4转导障碍，骨骼肌摄取、利用葡萄糖受阻，细胞能代谢降低，导致骨骼肌收缩功能障碍。骨骼肌根据其代谢方式和收缩特性可分为Ⅰ型纤维(又称慢纤维)和Ⅱ型纤维(又称快纤维)，Ⅰ型纤维主要以线粒体氧化供能，与肌肉耐力运动有关，如比目鱼肌(Soleus，SOL)；Ⅱ型纤维主要以无氧酵解供能，与肌肉爆发力或冲刺运动有关，如趾长伸肌(Extensor digitorum longus，EDL)。然而，在某些生理病理因素作用下，骨骼肌Ⅰ型和Ⅱ型纤维的构成比会发生改变；最近研究发现，遗传性胰岛素抵抗病人和2型糖尿病病人股外侧肌中Ⅰ型纤维含量减少而Ⅱ型纤维含量增加；有趣的是，给予外源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物大鼠和NOS敲除小鼠的骨骼肌也出现与胰岛素抵抗和糖尿病相似的骨骼肌纤维构成改变，提示NOS抑制可能与糖尿病骨骼肌病变有关。
大量研究证明，NO是一种广泛存在组织细胞的信号分子；在骨骼肌细胞，由nNOS和eNOS催化L-精氨酸合成的生理浓度一氧化氮(NO)，不仅可扩张骨骼肌血管、增加血流量；也可改善胰岛素敏感性，增加骨骼肌对葡萄糖的摄取、利用；此外，NO还促进骨骼肌线粒体生物合成，增加能量代谢，从而加强骨骼肌收缩。体内存在一种调节NO生成的内源性机制，NO合成前体L-精氨酸的同系物非对称二甲基精氨酸已被证明为NOS内源性抑制物，可与L-精氨酸竞争性抑制NOS，一方面减少NO合成，另一方面增加超氧阴离子产生，导致氧化应激。
内源性ADMA是由蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)催化含有精氨酸残基的蛋白质甲基化，再经蛋白水解释放而来，主要由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)降解为二甲胺和胍氨酸；因此，PRMT1和DDAH是调节内源性ADMA浓度的重要因子。我室和国内外学者大量研究表明，内源性NOS抑制物ADMA升高不仅与肥胖、胰岛素抵抗等代谢综合征密切相关，也在糖尿病心血管并发症的发生发展中起重要作用；最近研究发现，老年人血中ADMA浓度与骨骼肌收缩张力和步行速度呈负相关。综上所述，依据内源性NOS抑制物ADMA蓄积与胰岛素抵抗、糖尿病及其并发症、以及老龄性骨骼肌功能降低密切相关，提出如下科研假设：糖尿病内源性ADMA蓄积可能通过促进骨骼肌胰岛素抵抗导致其收缩功能障碍。
为了验证这一假设，本课题拟在不同病程糖尿病大鼠确定内源性ADMA蓄积与糖尿病骨骼肌收缩功能障碍的关系，然后观测NO合成前体L-精氨酸和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能障碍的治疗作用及其与胰岛素抵抗和氧化应激的关系；再在灌胃给予外源性NOS抑制物L-硝基精氨酸大鼠以及内、外源性NOS抑制物孵育的正常大鼠离体骨骼肌条和培养的大鼠骨骼肌细胞，观测ADMA或L-NNA对骨骼肌收缩功能的直接损害作用及其与胰岛素抵抗和氧化应激的关系；从而确定糖尿病时内源性ADMA蓄积与骨骼肌收缩功能障碍的因果关系，并阐明内源性NOS抑制物促糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能障碍的可能机制，为临床防治糖尿病骨骼肌病变发掘新靶点和有效药物。
实验方法与设计：实验分为糖尿病大鼠、外源性NOS抑制物L-NNA大鼠、正常大鼠离体骨骼肌药物孵育实验和大鼠L6成肌细胞实验等四大部分：
1.不同时程糖尿病大鼠及其分组：分别制备8w、12w、16w糖尿病大鼠模型，12w为1型、8w和16w为2型；1型糖尿病大鼠模型制备采用一次性给雄性SD大鼠(体重220±10g)腹腔注射链脲佐菌素(STZ，50mg/kg,溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,pH4.5,i.p.)，再常规饲养12w；2型糖尿病大鼠模型制备采用先高脂饲养3w，然后加小剂量STZ(30 mg/kg, i.p.)一次性腹腔注射，再继续高脂饲养8~16w。(1)8周糖尿病大鼠实验：分为①正常对照组，②糖尿病组(DM)，③L-精氨酸治疗的糖尿病组(DM+L-Arg)，④L-精氨酸治疗的正常大鼠组(L-Arg)；(2)12周糖尿病大鼠实验：分为①正常对照组，②糖尿病组(DM)，③N-乙酰半胱氨酸治疗的糖尿病组(DM+NAC)，④N-乙酰半胱氨酸治疗的正常大鼠组(NAC)；(3)16周糖尿病大鼠实验：分为①正常对照组和②糖尿病组(DM)。药物治疗是从糖尿病造模成功后(即注射STZ后第5天)灌胃给予L-Arg(100 mg/kg)和NAC(250 mg/kg)治疗至相应时程，对照组大鼠每天灌胃等体积生理盐水。
2.外源性NOS抑制物L-NNA大鼠模型及分组：将体重为200~230g雄性SD大鼠随机分为①正常对照组，②N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)处理组，模型组大鼠每天灌胃给予50mg/kgL-NNA，对照组大鼠每天灌胃等容积生理盐水，连续16周。
模型大鼠骨骼肌收缩功能测定：以上模型饲养结束后，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，颈动脉插管取血后迅速分离大鼠比目鱼肌(SOL)和趾长伸肌(EDL)置液氮快速冷冻后移至-80?C低温冰箱保存用于蛋白表达和生化测定；再分离大鼠另一条腿的SOL和EDL置于盛有10mlKrebs-Henseleit缓冲液并持续充以95%O2和5%CO2混合气体的器官浴槽，用两个不锈钢钩将肌条一端固定于浴槽，另一端连接张力换能器和生理信号记录仪，并将肌条中段处于电极刺激环中央，用电刺激法测定骨骼肌单次收缩和强直收缩的最大张力以反映骨骼肌收缩功能。
3.正常大鼠离体骨骼肌药物孵育实验及分组：麻醉下迅速分离正常SD大鼠的SOL和EDL，固定于器官浴槽，平衡后测定药物孵育前的肌肉收缩张力；然后分别进行以下药物孵育实验，再测定药物孵育后骨骼肌收的最大张力，并分别比较不同药物对SOL&EDL单次收缩和强直收缩最大张力的影响。(1)内外源性NOS抑制物的量效研究：在药物孵育前测定骨骼肌第一次收缩张力，然后平衡10min，再分别用不同浓度(10、30、100μM)ADMA或L-NNA孵育SOL和EDL40min，以确定ADMA和L-NNA的最佳剂量；(2)内外源性NOS抑制物的时效研究：将骨骼肌先分别平衡40、20、0min，再分别加入30μM的ADMA或L-NNA孵育SOL和EDL20、40和60min；以确定ADMA和L-NNA作用的最佳孵育时间；(3)药物对L-NNA引起骨骼肌收缩功能抑制的影响：实验分为①正常对照组：两次骨骼肌收缩功能测定之间平衡50min；②L-NNA损伤组：在检测第一次骨骼肌单次收缩和强直收缩后，先平衡10min，再加30μM的L-NNA孵育40min；③L-NNA+药物治疗组：在第一次收缩后，先分别加入NO合成前体L-精氨酸(L-Arg, 0.5 mM)或NO供体硝普钠(SNP,10μM)、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC,50μM)或吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,30μM)孵育骨骼肌10min，再加入30μM的L-NNA共孵育40min；④药物对照组：在第一次收缩后，分别加入相应药物单独孵育骨骼肌50min；孵育结束后，再检测各组骨骼肌的第二次单次收缩和强直收缩，以评价药物对外源性NOS抑制物L-NNA引起骨骼肌收缩功能抑制的影响。
4.大鼠骨骼肌L6细胞实验和分组：接种大鼠L6骨骼肌细胞于6孔板，培养至70%融合时分组处理如下：①正常对照组、②高糖损伤组(Glu)、③ADMA损伤组、④L-Arg+Glu组、⑤L-Arg+ADMA组、⑥L-Arg对照组、⑦NAC+Glu组、⑧NAC+ADMA组、⑨NAC对照组；正常对照组不加任何药物培养50h，高糖和ADMA组先常规培养2h再分别加入30mM葡萄糖或30?M的ADMA孵育48h，药物治疗组先加入3mM的L-Arg或10μM的NAC预孵育细胞2h，再加入30mM葡萄糖或30μM的ADMA共孵育48h；药物对照组加入3mM的L-Arg或10μM的NAC单独孵育细胞50h，然后收集细胞检测胰岛素信号通路蛋白表达以反映胰岛素抵抗。
5.蛋白表达和生化指标测定：用Westernboltting检测骨骼肌组织ADMA合成酶PRMT1、代谢酶DDAH和NOS以及胰岛素信号通路的磷酸化IRS-1和总IRS-1、磷酸化Akt和总Akt、胞膜Glut4和胞浆Glut4等蛋白表达；用高效液色谱测定血清ADMA浓度，ELISA测定骨骼肌ADMA含量和血请胰岛素水平，用比色法测定骨骼肌NO含量、NOS和DDAH活性；用萤火虫荧光素酶法测定骨骼肌ATP含量，还检测骨骼肌抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量以反映氧化应激。
实验结果：1.糖尿病大鼠实验结果：①模型鉴定：与正常对照组比较，8~16w糖尿病大鼠空腹血糖均明显升高(P＜0.05~P＜0.01)，口服糖耐量试验(OGTT)各时间点血糖浓度也显著升高，血糖曲线下面积(AUC)增加(P＜0.01)；用ELISA测得8w-和16w-2型糖尿病大鼠血浆胰岛素水平明显高于正常对照组，而12w-1型糖尿病大鼠血浆胰岛素浓度则低于正常对照组(P＜0.01,Tab.1)；这些结果表明糖尿病大鼠模型成功建立(Fig.1)。②骨骼肌收缩功能：8~16w糖尿病大鼠SOL单次收缩(P＜0.05~P＜0.01)和强直收缩以及EDL强直收缩(P＜0.01~P＜0.001)最大张力随病程增加而进行降低，在相同病程糖尿病大鼠同一肌肉强直收缩最大张力降低比单次收缩张力降低更明显(P＜0.05vsP＜0.01vsP＜0.001)，提示糖尿病大鼠SOL和EDL单次收缩和强直收缩呈病程依赖性抑制加重(Fig.2)；用NO合成前体L-Arg体内治疗8w可阻止糖尿病所致SOL和EDL收缩功能降低(P＜0.01,Fig.2A&B)，用抗氧化剂NAC体内治疗12还可翻转糖尿病所致SOL和EDL单次收缩(P＜0.001vsDM)和强直收缩(P＜0.01vsDM,Fig.2)的抑制作用，提示L-Arg和NAC对糖尿病骨骼肌收缩功能抑制有很好的治疗作用，其中NAC的治疗效果更佳。③PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路：与正常对照组比较，8~16w糖尿病大鼠血清ADMA浓度显著升高(P＜0.01,Fig.3~5A)，骨骼肌SOL和EDL组织ADMA含量明显增加(P＜0.05,Fig.3~5B)，DDAH及NOS活性抑制(P＜0.01,Fig.3~5C&D)、NO含量减少(P＜0.01,Fig.3~5E)；如图6~8所示，8~12w糖尿病大鼠SOL和EDL组织PRMT1和iNOS表达上调、而DDAH1和DDAH2以及eNOS和nNOS表达均下调(P＜0.01)，16w糖尿病大鼠骨骼肌PRMT1/DDAH/NOS通路蛋白表达趋势与8~12w糖尿病大鼠相似(P＜0.05)，提示糖尿病大鼠骨骼肌PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路紊乱；无论是用NO合成前体L-Arg体内治疗8w，还是用抗氧化剂NAC体内治疗12w，均可纠正8~16w糖尿病大鼠SOL的PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路紊乱(P＜0.01)以及改善糖尿病大鼠EDL该通路紊乱(P＜0.05)，提示L-Arg和NAC对糖尿病骨骼肌PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路紊乱有治疗作用，并且对SOL的效果更佳(Fig.3~8)。④相关性分析：用16.0SPSS统计分析软件进行直线相关分析，揭示大鼠骨骼肌ADMA含量与SOL和EDL单次收缩和强直收缩均呈负相关，提示内源性ADMA蓄积与糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能抑制密切相关。⑤胰岛素信号通路：与对照组比较，8~16w糖尿病大鼠骨骼肌IRS-1酪氨酸磷酸化和Akt蛋白磷酸化降低(P＜0.05,Fig.12~14)，Glut4膜转位减少(P＜0.01,Fig.12~14)，提示糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号转导障碍即胰岛素抵抗；用L-Arg治疗8w可改善(P＜0.05)、用NAC治疗12w可逆转(P＜0.01)糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗(Fig.12~13)。⑥ATP含量和氧化应激：与正常对照比较，8~16w糖尿病大鼠SOL和EDL的ATP含量均明显减少(P＜0.01,Fig.15A~C)，抗氧化酶Mn-SOD活性抑制(P＜0.05,Fig.16A,C,E)，脂质过氧化产物MDA含量增加(P＜0.05Fig.16B,D,F)，提示能量代谢降低、氧化应激增加；经抗氧化剂NAC治疗12w既可逆转糖尿病大鼠骨骼肌ATP含量减少(P＜0.01,Fig.15B)，又可阻止氧化应激增加(P＜0.05,Fig.16C-D)，提示抗氧化剂NAC可改善糖尿病大鼠骨骼肌线粒体代谢和氧化应激。
2.L-NNA大鼠模型结果：给正常大鼠灌胃L-NNA(50 mg/kg)16w可引起与糖尿病大鼠几乎完全相同的骨骼肌收缩功能损害(P＜0.01,Fig.17)、PRMT1/DDAH/NOS/NO通路紊乱(P＜0.05,Fig.18~19)和胰岛素信号转导障碍(P＜0.05,Fig.20)，提示NOS抑制是导致骨骼肌收缩功能障碍的重要原因。
3.正常大鼠离体骨骼肌药物孵育结果：量效和时效研究结果发现，用30?M内源性NOS抑制物ADMA和30?M外源性NOS抑制物L-NNA孵育正常大鼠离体SOL和EDL40~60min均可明显抑制其单次收缩和强直收缩(P＜0.05~P＜0.01,Fig.21~24)，但无明显的剂量依赖性；用NO合成前体L-Arg或NO供体SNP均可逆转L-NNA的抑制作用(P＜0.05,Fig.21~24)，且SNP效果更佳(P＜0.01)；抗氧化剂NAC和PDTC亦可逆转L-NNA的抑制作用(P＜0.01,Fig.26)，且PDTC效果更佳；提示NOS抑制物是导致骨骼肌收缩功能损害的直接原因。
4.大鼠骨骼肌L6细胞结果：与正常对照组比较，用30mM葡萄糖和30?M的ADMA孵育大鼠骨骼肌L6细胞48h，均可降低IRS-1酪氨酸磷酸化和Akt磷酸化，减少Glut4膜转位(P＜0.05,Fig.27)，表现出与糖尿病大鼠骨骼肌相似的胰岛素信号转导障碍或胰岛素抵抗；用NO合成前体L-Arg或抗氧化剂NAC治疗均可明显改善高糖和ADMA诱导的胰岛素抵抗(P＜0.05,Fig.27)；提示ADMA或高糖是诱导大鼠骨骼肌L6细胞胰岛素抵抗的直接因素。
实验结论：通过以上四部分研究结果，可得出如下实验结论：
1.糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能障碍与内源性NOS抑制物ADMA蓄积密切相关；
2.内、外源性NOS抑制物对大鼠骨骼肌收缩功能有直接的抑制作用；
3.内源性NOS抑制物ADMA引起糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能抑制可能与促进骨骼肌细胞胰岛素抵抗有关；
4.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和NO合成前体L-精氨酸对内源性ADMA蓄积引起糖尿病大鼠骨骼肌收缩功能损害和肌细胞胰岛素抵抗均有良好的治疗效果。