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【背景】胃癌发病率居世界恶性肿瘤第四位,死亡率居第二位,严重威胁着人类的健康和生命[1]。化疗是进展期胃癌治疗的主要手段之一,然而多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象的产生大大降低了化疗效果,目前已知的许多MDR相关分子机制仍不能完全解释胃癌MDR现象。因此,进一步探索MDR分子机制,寻找新的胃癌耐药相关分子及信号通路对逆转胃癌MDR具有重要意义。本课题组利用噬菌体表面展示肽库技术(phage display techniques),以胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR为阳性细胞,以结合能力为标准,采用生物淘选(biopanning)的方法,并通过药物敏感实验进行功能学筛选,获得了能够特异结合于胃癌耐药细胞、逆转胃癌MDR表型的系列短肽BMBPs(Gastric Multidrug-resistant Binding Peptides,BMBPs)。GMBP1是其中的一种,它能与多种胃癌耐药细胞特异性结合,具有逆转胃癌耐药的活性,并通过蛋白质组学方法进一步筛选并鉴定GMBP1结合受体为GRP78,研究发现GMBP1与GRP78结合后能够发生内化,但GMBP1与GRP78结合是否引起信号通路的活化或抑制,它是如何发生内化、内化后的亚细胞定位、是否激活新的信号通路,这些机制尚不清楚。因此,本课题拟通过流式细胞技术、si RNA技术及激光共聚焦显微镜等方法,研究GMBP1细胞内化的亚细胞定位及其机制;采用蛋白质组学技术及生物信息学方法分析GRP78介导GMBP1逆转耐药的关键分子。本研究旨在阐明GMBP1逆转胃癌耐药的分子机制,有望为胃癌耐药逆转治疗提供新方法。【目的】1.鉴定GMBP1及其受体GRP78亚细胞定位及GMBP1内化入细胞的机制。2.阐明GMBP1通过GRP78逆转胃癌耐药的分子机制,为胃癌耐药逆转治疗提供实验依据及可能的候选分子。【方法】1.通过免疫荧光和流式细胞技术分析短肽GMBP1及其受体GRP78在胃癌耐药细胞的结合靶点亚细胞定位。2.通过si RNA技术建立低表达GRP78的胃癌细胞系(si GRP78-SGC7901/ADR和si GRP78-SGC7901/VCR),利用Western blot和RT-PCR验证转染效率。3.通过免疫荧光技术验证短肽GMBP1进入胃癌耐药细胞是否是其受体GRP78介导引起的内化。4.选取经典的发生细胞内化的相关分子转铁蛋白,用荧光素标记,通过激光共聚焦分析与FITC-GMBP1共定位情况,揭示其内化途径。选取针对转铁蛋白内化途径的特异性抑制剂氯丙嗪,通过免疫荧光实验观察短肽FITC-GMBP1的内化能否被抑制,进一步证实短肽是通过该途径发生的内化。5.采用同位素标记差异蛋白定量分析(i TRAQ)技术,对短肽GMBP1作用胃癌耐药细胞的差异表达蛋白进行筛选。6.对筛选出来的差异蛋白进行生物信息学分析,即GO分类分析和KEGG信号通路分析,预测差异蛋白所参与的信号通路。7.通过Western blot技术验证筛选获得的差异蛋白在GMBP1作用前后耐药细胞中的表达情况。8.通过Western blot技术检测短肽GMBP1作用耐药细胞后差异蛋白、受体GRP78、耐药和凋亡相关分子的表达情况,初步分析GMBP1及其受体在胃癌多药耐药中的作用机制,为胃癌耐药逆转治疗提供新方法。【结果】1.短肽GMBP1内化入耐药细胞的机制1)免疫荧光实验结果证实,GRP78定位于耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR胞膜和核周胞浆。2)流式细胞结果显示,FITC-GMBP1与耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR结合后的平均荧光强度高于对照肽FITC-URP,这表明GMBP1与其受体结合后可内化入耐药细胞。3)Western blot和RT-PCR结果证明,GRP78特异性小干扰RNA转染后可有效降低胃癌耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中GRP78蛋白和m RNA的表达(P<0.01)。4)免疫荧光实验结果显示,特异性下调GRP78表达后,FITC-GMBP1在耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR内的荧光强度较对照组明显减弱,初步证实短肽GMBP1进入细胞是其受体GRP78介导的内化。5)激光共聚焦实验结果显示,FITC-GMBP1(绿色荧光)与Alexa Fluor(AF)-594(红色荧光)标记的转铁蛋白共定位于胞浆内(黄色荧光),氯丙嗪抑制转铁蛋白功能后,FITC-GMBP1内化荧光明显减弱,证实GRP78介导短肽GMBP1内化入耐药细胞可能是通过转铁蛋白途径发生的。2.短肽GMBP1作用耐药细胞后差异表达蛋白的筛选1)对短肽GMBP1作用前后两个胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后的蛋白进行i TRAQ筛选,在GMBP1作用后,SGC7901/ADR共鉴定出3752个蛋白,SGC7901/VCR共鉴定出3749个蛋白质。将GMBP1作用后的蛋白表达差异倍数小于0.8倍,p值小于0.05的蛋白定义为下调蛋白,蛋白表达差异倍数大于1.5倍,p值小于0.05的蛋白定义为上调蛋白,我们获得了一组胃癌多药耐药相关蛋白。在GMBP1作用SGC7901/ADR细胞系后,发现共有95个上调蛋白和48个下调蛋白;在GMBP1作用SGC7901/VCR细胞系后,发现共有129个上调蛋白和88个下调蛋白。其中发现EIF4E和CTBP2在两个细胞系共同下调。2)运用生物信息学技术对筛选得到的蛋白进行GO分类分析和KEGG通路分析。GO分析从细胞成分(cellular components,CC)、生物学途径(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)三方面进行注释。KEGG分析显示,短肽GMBP1作用于SGC7901/ADR细胞后差异蛋白参与了38条KEGG通路,短肽GMBP1作用于SGC7901/VCR细胞后差异蛋白参与了79条KEGG通路。我们对这些通路进行富集分析,将前十条显著富集的KEGG进行整理,结果发现EIF4E和CTBP2在GMBP1作用于两个细胞系后均下调,并且发现CTBP2参与了Wnt信号通路,差异蛋白EIF4E是PI3K/Akt信号通路的下游分子。3.短肽GMBP1作用耐药细胞后差异表达蛋白的鉴定及其在胃癌耐药中的作用机制1)Western blot结果显示,EIF4E和CTBP2在两个胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR均高表(P<0.01),GMBP1作用耐药细胞后,EIF4E和CTBP2表达均下降,结果与i TRAQ结果一致。2)Western blot结果显示,GMBP1作用耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后,GRP78、MDR1、Bcl-2的表达水平明显降低,而Bax的表达增高。【结论】1.短肽GMBP1与其受体GRP78特异性结合后定位于胞浆及胞膜,GMBP1内化入耐药细胞是其受体GRP78介导、通过经典的转铁蛋白途径发生的。2.通过i TRAQ技术结合生物信息学分析,完成胃癌多药耐药相关蛋白高通量筛选,获得一组GMBP1作用耐药细胞后差异表达蛋白分子。其中,GMBP1作用SGC7901/ADR细胞系后,上调蛋白95个,下调蛋白48个;GMBP1作用SGC7901/VCR细胞系后,上调蛋白129个,下调蛋白88个。候选分子EIF4E和CTBP2在多种耐药细胞中表达变化一致,可能发挥关键作用。3.GMBP1作用耐药细胞后,EIF4E、MDR1表达明显降低,Bcl-2/Bax比值下降。因此推测,GMBP1与膜转位GRP78结合,通过阻断AKT/PI3K信号通路而下调EIF4E表达,直接或间接降低MDR1的表达和Bcl-2/Bax的比例,从而逆转胃癌多药耐药。其具体机制尚需进一步深入研究。