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老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)是一种渐进性神经退行性疾病,其病理特征是渐进性的老年斑沉积,神经突触丢失和神经纤维缠结,临床表现为记忆功能衰减及识别能力障碍,同时伴有各种神经症状和行为障碍。在老年人群,具有非常高的发病率,目前还没有特异性治疗药物。近年来AD的发病机理和药物研究方面都有突破性进展,尤其是制备针对β淀粉样蛋白(amyloid beta protein,Aβ)特异性抗体药物成为AD治疗极具价值的途径。噬菌体展示技术(phage display)为抗体制备开创了一条简便、快速的基因工程抗体制备方法。噬菌体抗体是在噬菌体表面表达抗体分子的抗原结合片段(Antigen binding fragment,Fab)或单链抗体(single chain fragment variable, scFv),单链抗体具有分子量小,免疫原性低,穿透力强,定位迅速,易于基因工程制备和改造等优点。通过构建和筛选人源性天然噬菌体抗体库,得到Aβ寡聚体特异性人源性单链抗体,可直接应用于人AD的治疗。利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体。分离10个健康人外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR法得到cDNA链,以cDNA链为模板扩增得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得库容为2.5×109单链抗体库。以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行四轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E.coli HB2151,诱导表达可溶性scFv。SDS-PAGE及Western Blot分析结果显示可溶性scFv获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,可溶性scFv与Aβ1-42寡聚体的亲和常数为9×10-6 mol/L。将单链抗体的重链和轻链可变区基因克隆入原核表达载体pComb3C/cFab中,转化TOP10感受态,诱导表达了重组抗体B19-Fab。SDS-PAGE及Western Blot分析结果显示,重组抗体B19-Fab得到了正确的表达。ELISA结果显示,重组抗体B19-Fab仍然保持对Aβ1-42寡聚体特异性结合活性。对单链抗体亲和力成熟进行的初步研究为后续的打下了良好的基础。本实验中获得的Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体为老年性痴呆症(AD)的临床治疗研究奠定了基础。