牛膝(Achyranthes bidentata Blume.)为苋科(Amaranthaceae)、牛膝属(Achyrarthes L.)多年生草本植物,以干燥根入药,是我国重要的大宗中药材之一。自明朝以后,其主要产区集中于河南古怀庆府地区(即现在的武陟、温县、沁阳、孟县、辉县、博爱一带),并将产于古怀庆府的牛膝称为怀牛膝,是我国著名的四大怀药之一。牛膝的主要药用成分是三萜皂苷元-齐墩果酸、蜕皮甾酮及多糖。本文运用植物解剖学、组织化学和植物化学等方法,系统研究了牛膝各器官的形态结构和发育规律、三萜皂苷在牛膝营养器官中的组织化学定位、不同季节播种的牛膝生长发育过程中三萜皂苷积累动态和变化规律、正常时节播种的牛膝生长发育过程中蜕皮甾酮的积累动态和变化规律,并对不同产区牛膝根的形态和主要药用成分齐墩果酸、蜕皮甾酮、多糖的含量、药材和土壤中无机元素的含量以及产区的气候和栽培土壤的理化状况进行比较研究和相关性分析,在此基础上探讨牛膝道地性形成的可能机制。研究结果如下。在牛膝的轴器官根及茎中均存在由额外形成层分化产生的三生结构。牛膝根及茎的发育均包括原分生组织、初生分生组织、初生生长、次生生长和三生生长5个发育阶段。在牛膝根、茎的发育过程中,其初生生长和早期的次生生长都类似于一般双子叶草本植物。其根的初生木质部多为二原型,次生结构从外到内由周皮和次生维管组织组成,其木栓形成层由中柱鞘细胞恢复分裂能力而形成,而根的进一步加粗主要是由于三生结构的发生和分化。其第一圈额外形成层产生于次生韧皮部外侧的薄壁组织细胞和射线细胞,以后的每一圈由前一圈向外衍生的薄壁组织细胞产生;额外形成层无纺锤状原始细胞和射线原始细胞之分,在切向纵切面上呈叠生排列;三生维管束以离心方式排成整齐的同心环状,由薄壁结合组织将其彼此分开,其圈数与额外形成层的圈数是一致的,以后随着根的发育而不断增加,通常一年生的牛膝根中可形成4-5圈三生维管束。在茎的发育过程中,次生维管组织仅由束中形成层产生,束间形成层未分化。当次生维管束分化即将完成时,其正常维管柱外侧保留的1-2层原形成层细胞恢复分裂能力,产生一轮额外形成层,额外形成层开始只向内交替产生木质部和其间的结合组织,后来向外产生三生韧皮部,形成一轮三生维管束;其茎的髓中具2个外韧型髓维管束,来源于原形成层,而与正常维管束在位置上没有相关性,但其结构类型存在多样性,包括不完全的周木型髓维管束。牛膝的叶为典型的异面叶,其结构、发生和发育类似一般被子植物的叶器官,由表皮、叶肉和叶脉组成,表皮上的气孔器仅分布在叶片背面,而上、下表皮上均分布有长、短不同的两种类型的非腺毛,其组成细胞的数目明显不同。叶肉中栅栏组织由3—4层细胞组成,细胞含叶绿体多,海绵组织疏松,细胞形状不规则,含叶绿体较少。主脉由数个呈环状排列的外韧型维管束组成。叶柄呈半圆形,无髓维管束,7—8个大小不等的外韧型维管束呈半圆形排列于其薄壁组织中。牛膝为两性花,异花授粉。雄蕊5枚,花药具4个长圆形的花粉囊,分为左右两部分,每部分各有两个花粉囊,花粉呈椭圆形,其表面具颗粒状突起纹饰。雌蕊比雄蕊长,由1枚心皮构成,子房上位,1室,含1个胚珠,柱头单一,其顶端的表皮形成指状突起,为湿性柱头。花柱中空,其内表皮细胞向内形成乳状突起,构成了特殊的通道细胞。胞果由果皮和一枚种子组成,其种子类型为双子叶有胚乳种子。牛膝营养器官中三萜皂苷的组织化学定位及扫描电镜与X-射线能谱仪分析研究表明,在根的初生结构中,皂苷类物质主要分布于中柱鞘、初生韧皮部及初生韧皮部和初生木质部之间的薄壁组织细胞内;在根的次生结构中,主要分布于次生韧皮部及栓内层的薄壁组织细胞内;当三生结构形成后,除次生韧皮部及栓内层细胞外,在额外形成层和三生维管束韧皮部细胞内均有皂苷类物质积累。在茎中,三萜皂苷主要分布于正常维管束和髓维管束的韧皮部,而在叶中主要分布于栅栏组织细胞及叶脉维管束的韧皮部组织细胞中。三生结构在牛膝根中占主要地位,是三萜皂苷积累与分布的主要场所;茎是其转运器官,而叶片中的栅栏组织细胞可能是皂苷类物质合成的场所。植物化学研究表明,不同季节播种的牛膝,其根中齐墩果酸含量的动态变化趋势基本一致,呈“高-低-高”的变化趋势,生殖生长不利于根中皂苷类物质的积累;春季播种的牛膝生长周期长,但其产量与夏季播种的牛膝并没有明显的差异,齐墩果酸的含量低于夏季播种的牛膝,因此7月上旬为怀牛膝最适播种期,晚播可提高土地的利用率,而且牛膝的产量和质量都可达到最高水平。对牛膝生长发育过程中蜕皮甾酮含量的动态变化研究表明,营养生长期是牛膝各器官中蜕皮甾酮积累的最佳时期,但生殖生长不利于根中蜕皮甾酮的积累。至11月,牛膝各器官中蜕皮甾酮的含量差异依次为果实＞叶＞根＞茎。由此表明,牛膝的叶是蜕皮甾酮的合成场所,果实是其主要贮存器官,根是其次要贮存器官,而茎可能主要起运输的作用。在牛膝的整个生长过程中,叶中的蜕皮甾酮含量始终维持在较高的水平,可能与其传粉昆虫的生物学行为及活动有一定的相关性,从而提示蜕皮甾酮在牛膝中的存在具有一定的化学生态学意义。11月牛膝植株的地上部分临近枯萎,根的增长、加粗、三生维管束圈数、根的生物量及三萜皂苷和蜕皮甾酮的含量均达到了高峰,是其最佳采收期。在传统用药时,牛膝仅以根经不同炮制而入药,地上部分全部舍弃。但此时地上部分的茎、叶中仍含有一定量的三萜皂苷和蜕皮甾酮,其果实中含量尤其高,建议在种植集中的道地产区对牛膝的茎、叶,尤其是果实,进行综合开发利用。对不同产区牛膝药材的比较研究表明,牛膝根的外观存在一定差异,道地产区牛膝的根身条通顺、长而粗壮,但与非道地产区牛膝根的内部结构无明显区别;道地产区根中主要药用成分齐墩果酸、蜕皮甾酮和多糖的含量及无机元素铬的含量均高于非道地产区,而锌的含量低,对铁、铜、铬和磷的富集能力强;道地产区土壤中锌、硼、锰、铝的含量高,铜的含量低。牛膝药材与土壤中无机元素含量均呈显著相关,牛膝对钠和铝、钛,钙和镁、硼、镉,镁和硼,铝和镉,镉和钛的吸收和积累有协同作用,对铅和铜、钾,铬和硼、锌的吸收和积累则呈明显的拮抗关系。药材中齐墩果酸和多糖、微量元素铬的含量呈明显的正相关,而微量元素钙、镁、硼、锌等则不利于齐墩果酸在根中的积累。道地产区较低的年均蒸发量有利于牛膝根中蜕皮甾酮和多糖的积累,土壤中含量较低的速效磷、速效钾则有利于根中齐墩果酸的积累。