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[背景]内皮唾液酸蛋白(Endosialin),又称为CD248或肿瘤内皮标志物1(Tumor endothelial marker 1,TEM-1),是基质细胞产生的一种细胞表面糖蛋白[1]。在胚胎发育中高表达,伴随个体出生表达量逐渐降低,在健康成年个体中除肾脏、子宫内膜外基本不表达。CD248在1992年被发现,随后研究发现CD248在肿瘤患者基质纤维细胞和周细胞上表达增高,其表达与肿瘤的预后和进展相关。敲除CD248基因后小鼠能够正常生长发育,但是在成瘤实验中成瘤体积明显减小、肿瘤侵袭转移能力降低[2,3]。最近研究发现,除肿瘤外,CD248与脏器的纤维化发生发展也密切相关[4]。人类肾/肝/肺纤维化临床标本中CD248表达水平与组织纤维化程度呈正相关。在小鼠模型中,敲除CD248基因可显著抑制纤维化发生。基于CD248在肿瘤、纤维化等慢性炎症性疾病中的重要作用,CD248的研究越来越受到重视[5,6]。[研究目的]本研究拟通过杂交瘤技术筛选CD248特异性单克隆抗体,对筛选到的特异性抗体在肿瘤、纤维化样本临床检测应用进行评估,为探索以CD248为靶标的肿瘤及纤维化疾病的诊疗研究奠定基础。[方法]1.采用原核系统表达CD248重组蛋白。2.通过杂交瘤技术筛选抗CD248特异性单克隆抗体。3.构建双抗体夹心捕获CD248抗原ELISA检测方法。4.采用双抗体夹心ELISA、Western blotting检测肿瘤及肾纤维化患者血清、尿液中CD248表达情况。5.采用免疫组化法(IHC)检测单侧输尿管结扎(UUO)小鼠肾纤维化模型及临床纤维化肾脏CD248表达情况。[结果]1.通过原核系统表达、纯化后获得CD248重组蛋白。2.筛选出9株抗CD248单克隆抗体;抗体亲和常数介于1.2×1010 L/mol-8.7×1010 L/mol;Western blotting分析9株单抗均可与重组CD248、骨肉瘤SJSA-1细胞膜蛋白CD248反应;流式细胞术检测单抗均可与骨肉瘤SJSA-1细胞结合;竞争抑制实验分析9株单抗至少识别3个完全不相关表位;经HRP标记后可以获得效价1:3 200～1:102 400标记单抗。3.建立以单抗CD248-M7作为捕获抗体,CD248-M41-HRP作为检测抗体的双抗体夹心ELISA法。该法检测MBP-CD248灵敏度为9.77 ng/mL。4.采用构建的ELISA法、Western blotting分析健康人血清中CD248含量与肿瘤患者、肾纤维化患者并无明显差异。5.采用IHC分析UUO小鼠肾纤维化模型及临床肾纤维化肾脏组织发现CD248表达水平与纤维化程度密切相关。6.Western blotting分析113例蛋白尿液标本表达CD248情况:急性非肾脏病组阳性率13.3%;慢性肾脏病(CKD)患者组检测阳性率在45%以上,其中CKD-5患者阳性率65%。检测结果进行χ2检验,各组检测结果具有统计学意义(χ2=97.07,v=5,p<0.05)。[结论]1.通过杂交瘤技术,成功应用基因工程方法获得的CD248重组蛋白,以此作为主要免疫原筛选出抗CD248特异性单克隆抗体。2.筛选的抗CD248单抗可以通过ELISA、免疫印迹、免疫组化的方法对肿瘤、纤维化各种标本进行检测。3.肿瘤患者、肾纤维化患者血清中CD248含量采用目前构建方法检测无明显变化。4.CD248单抗可作为临床检测分析肾纤维化工具。5.蛋白尿CD248水平可能可以作为肾纤维化评估指标之一。