研究背景:人肺动脉平滑肌细胞（HPASMCs）功能紊乱是引起肺血管重构的重要因素。低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞异常分化、增殖、迁移是导致肺小动脉持续收缩,动脉压力增高的关键病理机制。课题组前期研究已发现在慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺心病患者肺组织和低氧处理的HPASMCs中lnc RNA-RP11表达升高,miR-135a表达降低,Rab26表达升高。故提出:低氧使lnc RNA-RP11启动子发生去甲基化,上调lnc RNA-RP11表达,通过内源性竞争结合作用吸附miR-135a,间接上调miR-135a靶基因Rab26表达,促进HPASMCs的表型转化及异常增殖,导致肺血管重构、肺动脉高压形成。自组装DNA纳米材料具有结构可控性高,生物兼容性好等特点,在生物医学等方面有巨大的应用潜力。然而,其在生理条件下稳定性相对较差,急需新的组装策略和功能化以适应生物医学应用需求。碱性氨基酸分子（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）在生理条件下携带正电荷,具备介导DNA自组装成规整结构的潜力。故提出利用碱性氨基酸代替传统镁离子介导组装DNA纳米结构。同时,构建携带si RNA或miRNA的DNA纳米材料,并在肿瘤细胞中验证其功能;进而将其应用于HPASMCs中,为HPASMCs异常增殖导致的肺血管重构治疗提供新的纳米干预策略。研究方法:1.自组装DNA纳米结构的设计和构建（1）利用SEQUIN软件设计DNA纳米管。通过对DNA组装链中的一条进行延长,使其能够通过碱基互补配对结合目标si RNA和miRNA。利用Cadnano软件设计DNA纳米四边形结构。（2）应用非变性凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳法、激光动态散射法（DLS）对DNA纳米管、四边形结构进行表征。（3）非传统自组装DNA纳米材料构建。利用碱性氨基酸介导组装DNA纳米管、四边形结构,通过PAGE、琼脂糖凝胶电泳法、DLS以及原子力显微镜（AFM）进行表征,研究合成DNA纳米材料所需的浓度、温度和p H值。2.自组装DNA纳米材料生物兼容性评估及其应用于细胞的初步验证（1）通过PAGE检测氨基酸介导自组装DNA纳米材料的稳定性。（2）利用MTT法检测氨基酸介导自组装DNA纳米材料对肿瘤细胞的毒性。（3）通过流式细胞术、激光共聚焦检测肿瘤细胞对氨基酸介导组装DNA纳米材料的摄取效率,观察纳米材料在肿瘤细胞中的位置。（4）通过流式细胞术、激光共聚焦检测肿瘤细胞对功能化DNA纳米管的摄取。（5）通过RT-q PCR、核质分离实验,研究lnc RNA PVT1在肿瘤细胞中的表达分布。（6）通过MTT法检测携带lnc RNA PVT1 si RNA的DNA纳米管对肿瘤细胞增殖的影响。通过蛋白质印迹法（WB）检测肿瘤细胞相关蛋白的表达。3.自组装DNA纳米材料通过miR-135a-Rab26轴调控HPASMCs增殖机制（1）通过RT-q PCR、WB检测HPASMCs中miR-135a、Rab26的表达情况。（2）利用DNA纳米管递送miR-135a,通过CCK-8法检测低氧条件下上调miR-135a对HPASMCs增殖的影响。（3）利用携带si RNA的DNA纳米管敲低Rab26,通过RT-q PCR法测定其敲低效果,通过CCK-8法测定细胞活力。（4）利用RT-q PCR法检测低氧和纳米材料对平滑肌收缩型标志物α-SMA、HPASMCs表型、和HPASMCs表面AT2R受体的影响。研究结果:1.成功设计并构建了DNA纳米管、DNA纳米四边形;其合成产率较高,粒径大小符合理论设计。2.精氨酸、赖氨酸能在一定浓度范围内介导合成DNA纳米管和四边形,其粒径大小、形态符合理论设计。精氨酸、赖氨酸有较宽的p H范围和恒温条件下介导DNA自组装能力;组氨酸难以合成DNA纳米结构。3.（1）精氨酸组装的DNA纳米材料结构稳定性和热稳定性较高。（2）氨基酸介导自组装DNA纳米材料细胞毒性较低。（3）相对Mg2+合成的DNA材料,氨基酸组装的DNA纳米材料摄取效率更高;精氨酸介导组装的DNA纳米管主要富集在细胞膜上,Mg2+组装的DNA纳米管位于细胞内。4.（1）lnc RNA PVT1在A549等肺腺癌细胞中表达显著升高。（2）肺腺癌细胞对DNA纳米管的摄取效率较高。（3）通过核质分离实验发现lnc RNA PVT1在细胞核和细胞质中均有表达。（4）携带lnc RNA PVT1 si RNA的DNA纳米管能很好地抑制肿瘤细胞增殖,其通过上调Bax蛋白抑制肿瘤细胞增殖。5.自组装DNA纳米材料通过miR-135a-Rab26轴调控HPASMCs增殖机制:（1）低氧条件下,HPASMCs中miR-135a表达降低,α-SMA的表达降低,Rab26升高。（2）低氧条件下,通过DNA纳米管递送miR-135a,HPASMCs的增殖受到抑制。（3）构建携带Rab26 si RNA的DNA纳米管,其敲低HPASMCs中Rab26效果良好,敲低后HPASMCs的细胞增殖降低。（4）DNA纳米管敲低Rab26后α-SMA表达升高,平滑肌细胞合成型标志物VIM、MMP2表达减低,AT2R基因表达升高,HPASMCs向收缩型分化,增殖降低。结论:1.成功设计和构建了DNA纳米管和DNA纳米四边形;DNA纳米管可以携带多个si RNA、miRNA的功能单元。精氨酸、赖氨酸能够在一定浓度、p H值、温度下成功合成DNA纳米结构。2.相较于Mg2+,氨基酸组装的DNA纳米材料生物兼容性好,毒性低,更易被肿瘤细胞摄取。携带si RNA的DNA纳米管在肿瘤细胞中能够高效的沉默目标基因,抑制肿瘤细胞增殖。3.通过携带Rab26 si RNA和miR-135a的DNA纳米管敲低Rab26,递送miR-135,验证了如下假说:低氧下调lnc RNA-RP11启动子甲基化水平,上调lnc RNA-RP11表达,通过“海绵吸附”作用下调miR-135a,间接上调Rab26表达,从而促使HPASMCs异常增殖、表型转化。同时,我们的研究表明,携带核酸药物的DNA纳米材料是一种潜在靶向Rab26和miR-135a的调节肺动脉平滑肌细胞增殖新工具。