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血管紧张素转移酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)研究主要集中在啮齿类动物和人类,其他动物,如牛、羊、猪等方面的资料较少或没有。其在不同组织器官中良好的抗炎抗损伤作用也被广泛认可,但在肠道中的作用尚不清楚。本研究以猪为研究对象,应用现代分子生物学等技术建立猪ACE2原核和真核表达体系,制备ACE2多克隆抗体,并获得ACE2活性蛋白,采用LPS建立猪上皮细胞(IPEC-J2)炎性损伤模型,对ACE2的抗炎作用进行了初步探讨。研究包括以下三方面:1.猪ACE2基因的原核表达、多克隆抗体制备及在猪体内的表达分布本章研究以苏姜猪为研究对象,通过原核表达获得猪特异的ACE2重组蛋白,通过改变IPTG刺激终浓度和时间以探究目的蛋白最佳表达条件,经Ni2+-NTA亲和层析和KC1染色切胶两种方法纯化重组pET-32a-ACE2融合蛋白包涵体后,将其作为免疫抗原制备多克隆抗体,并对其进行免疫原性及特异性验证,免疫组化法确定ACE2在猪各组织中的细胞学定位。结果:1)本研究利用PCR技术成功扩增了猪ACE2基因编码区序列,大小2418bp,编码805个氨基酸。同源性显示该猪ACE2基因具有较高保守性,与山羊遗传距离最近。生物信息学显示该ACE2蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白,亲水性较好,1-17aa之间存在一个蛋白信号肽;2)构建了 pET-28a-ACE2和pET-32a-ACE22种ACE2蛋白原核表达载体,转化DH5α、BL21表达感受态后,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为10h,采用pET-32a-ACE2原核表达载体时,ACE2蛋白在E.coli BL21(DE3)中表达量最高,且以包涵体形式存在。表达产物的分子质量约为1OOkDa,与预期目的蛋白分子质量相符;3)选用的Ni2+-NTA亲和层析和KC1染色切胶两种方法纯化重组pET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化的蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性;4)利用纯化的ACE2重组蛋白免疫Wastar大鼠,成功制备了鼠抗猪源ACE2多克隆抗体,间接ELISA法鉴定抗体效价为1:3200,Western blot鉴定该抗体具有良好的专一性及免疫反应特异性;5)免疫组化结果表明,ACE2在猪各组织器官中均有表达,尤其在胃底的黏膜上皮层、小肠的肌层、浆膜层、绒毛上皮层,大肠中的肠腺中高表达。2.真核表达载体pcDNA.3.1(+)-ACE2的构建、转染表达及其酶活性鉴定本章旨在构建稳定的真核表达细胞系,获得具有ACE2酶活性的活性蛋白,为后续研究奠定基础。研究采用猪十二指肠进行如下实验:1)RT-PCR扩增出猪ACE2全长序列,单、双酶切鉴定正确后与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,转染至CHO细胞,经G418初步筛选后再经单克隆进一步筛选,使重组质粒能在CHO细胞中稳定表达;2)Western blot及免疫荧光法检验ACE2基因在蛋白质水平上的表达;3)比色法定量测定细胞中ACE2酶活性。结果:1)体外成功构建了 ACE2真核表达载体pcDNA3.1(+)-ACE2;2)Western-blot检测显示在CHO细胞中成功筛选出7株pcDNA3.1(+)-ACE2细胞株。免疫荧光进一步证实ACE2确实过表达在CHO细胞中;3)比色法结果表明CHO细胞中提取的ACE2蛋白具有酶活性,活性大小为7.42 nmol FAP/min。本研究成功构建了 pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,并筛选出7株pcDNA3.1(+)-ACE2稳定细胞株,证实CHO细胞中表达的ACE2具有较好的酶活性,提取获得了一定量的ACE2活性蛋白,为后续探究ACE2的生物学作用奠定基础。3.ACE2在LPS致猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)炎症损伤中的作用研究以LPS致猪IPEC-J2细胞炎性损伤,对ACE2的抗炎作用进行了探讨。进行如下实验:1)免疫荧光法确定ACE2在IPEC-J2细胞中的表达;2)用不同浓度LPS诱导IPEC-J2细胞炎性损伤,通过检测细胞活力、炎性细胞因子释放以及细胞线粒体的膜电位变化确定最佳诱导时间;3)Western Blot法检测不同浓度LPS(1ng/mL、10 ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL)刺激 IPEC-J2 细胞 4h 后 ACE2、ACE、AT1R和MasR的表达水平;RIA以及ELISA法分别检测细胞上清中Ang II和Ang1-7的含量。结果:1)ACE2蛋白在IPEC-J2细胞上有表达,主要定位在细胞膜上;2)不同浓度LPS处理细胞4h后,IPEC-J2细胞出现典型的炎症损伤,表现细胞活力下降,促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明显增高,细胞线粒体膜电位明显下降;3)LPS处理细胞4h后,ACE2、MasR表达水平以及Ang1-7含量随细胞损伤程度的增加而下降,而ACE、AT1R、Ang II的表达水平则呈现相反趋势,且ACE/ACE2表达水平的比值呈现先下降后上升的趋势。这些结果提示在不同浓度LPS处理IPEC-J2细胞4h后均可诱导细胞炎症损伤,ACE2/Ang1-7/MasR和ACE/AngⅡ/AT1R两条轴均被激活。在低浓度LPS刺激时,ACE2/Ang1-7/MasR轴起主要作用,ACE2通过降解AngⅡ介导Ang1-7/MasR发挥抗炎性损伤作用;在高浓度LPS刺激时,ACE/AngⅡ/AT1R通路的促炎作用占优势。