背景和研究目的:随着不孕人群的增长,不孕不育成为不容忽视的热点问题,而生殖道感染是女性不孕症最常见的病因。其中,慢性子宫内膜炎（Chronic endometritis,CE）在不孕症患者中患病率高,并与辅助生殖治疗的胚胎着床率及妊娠结局显著相关。目前,抗生素是CE的主要治疗方式,但存在抗生素耐药及复发率高等弊端,寻找一种新型有效的治疗方式,对于降低CE复发率及改善不孕症患者的着床率及妊娠结局具有重要意义。近年来的研究发现,以乳酸杆菌为优势菌种的女性生殖道微生物,在治疗生殖道感染性疾病及维持女性生殖健康中具有重要的作用。但目前关于生殖道微生物治疗的研究多集中于阴道炎和宫颈炎等下生殖道感染,对于CE的治疗及生殖健康的作用鲜有报道。因此,本课题选取了一株健康妇女阴道来源的卷曲乳酸杆菌（Lactobacillus crispatus）,验证其益生性质,并通过构建慢性子宫内膜炎动物模型探讨其对CE的改善效果及相关作用机制,之后进一步探究其对胚胎着床的影响及潜在的机制。实验方法:1.卷曲乳酸杆菌体外益生性质评估用相应的液体培养基复苏卷曲乳酸杆菌,在37℃恒温培养箱中培养36 h,保存菌株用于后续实验。通过绘制生长曲线、耐酸实验、抗氧化性实验(DPPH自由基、羟基自由基、超氧自由基清除能力的测定,对Fe2+的螯合能力的测定以及总还原力的测定)、抑菌实验和细胞黏附实验等体外实验评价卷曲乳酸杆菌的体外益生性质。2.卷曲乳酸杆菌对CE模型雌鼠的影响及作用机制探究（1）动物模型建立与实验分组:取6-8周龄左右雌性BALB/c小鼠65只,进行随机分组,分别为:空白对照组（C组）、子宫内膜炎模型组（M组）、抗生素治疗组（Abx组）、卷曲乳酸杆菌治疗组（L组）、抗生素联合卷曲乳酸杆菌治疗组（L+Abx组）,每组13只小鼠。混合抗生素饮水24 h后通过单次子宫内注射病原菌混合溶液建立CE雌鼠模型,空白组给予注射无菌PBS进行对照。造模第3周,通过组织病理学检测确定模型建立;（2）阴道给药干预:造模成功后,给予以下处理:空白对照组（C组）及子宫内膜炎模型组（M组）:阴道置入用10μL PBS浸润的明胶海绵,连续1周。抗生素治疗组（Abx组）:阴道置入用10μL甲硝唑溶液（30 mg/m L）浸润的明胶海绵,连续1周。卷曲乳酸杆菌治疗组（L组）:阴道置入用10μL卷曲乳酸杆菌（1×10~7CFU/m L）菌液浸润的明胶海绵,连续1周。联合治疗组（L+Abx组）:按Abx组干预方法处理3天,停用抗生素12 h后再按L组处理4天,共1周。治疗结束后,每组预留4只雌鼠,进行后续的研究,收集其余雌鼠血液、阴道分泌物,取小鼠子宫组织进行相关实验以评价治疗效果;（3）机制分析:通过子宫组织HE染色检测小鼠子宫内膜组织病理学改变,以对比CE小鼠治疗前、后子宫内膜损伤及炎症细胞浸润情况;通过Western-blot检测炎症通路相关蛋白TLR4、My D88、NF-κB、IκB在子宫内膜组织中的表达;利用q PCR技术检测炎症相关细胞因子:IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α以及小鼠子宫内膜中的金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌以及乳酸杆菌的生物载量的表达情况。3.阴道卷曲乳酸杆菌对胚胎着床的影响及机制探究（1）实验动物与分组:干预治疗结束后将对照组小鼠和不同干预组预留的CE小鼠与正常雄鼠按雌雄比4:1的比例合笼。于次日上午检查雌鼠阴道栓,观察到阴道栓视为受孕0天,合笼期不超过两周。合笼后小鼠进行分组,分别为:空白对照组（C组）、正常着床组（CIM组）、子宫内膜炎模型组（M组）、抗生素治疗组（Abx组）、卷曲乳酸杆菌治疗组（L组）、抗生素联合卷曲乳酸杆菌治疗组（L+Abx组）。受孕后第5天（着床期）,收集组织样本,观察胚胎着床数量,同时对比各组胚胎着床的差异,取器官组织进行组织病理学及分子生物学检测;（2）机制分析:通过免疫组化染色检测着床相关因子VEGF及MMP9的表达情况;通过q-PCR检测子宫内膜中着床相关因子VEGF、IHH（分泌型蛋白IHH）、BMP2（骨成型蛋白2）、Wnt4（分泌型糖蛋白4）、HGF（干细胞生长因子）、CSF（集落刺激因子）、IGF（胰岛素样生长因子）、EGF（表皮生长因子）在转录水平的差异表达情况;通过Western-blot技术检测着床相关细胞因子VEGF、MMP9蛋白水平的表达以及着床相关信号通路关键蛋白（Wnt4、BMP2、β-catenin）的表达情况。实验结果:1.卷曲乳酸杆菌体外益生性质评估（1）生长曲线测定结果显示,该卷曲乳酸杆菌菌株24 h左右进入生长稳定期,4-18 h为其生长对数期。另外,生长至18 h左右,卷曲乳酸杆菌OD600的值最高,点板计数结果显示菌落数约为1.9×1010CFU/m L。上述结果说明,阴道卷曲乳酸杆菌具有良好的生长性能;（2）耐酸实验结果显示,卷曲乳酸杆菌在p H值3.0-7.0范围内,可稳定生长,维持菌落计数＞10~8CFU/m L。在p H=5.0的培养条件下该菌株生长活性最好,培养4 h后活菌计数约为5.7×10~9CFU/m L。上述结果说明该卷曲乳酸杆菌对酸性环境具有良好的耐受性;（3）体外抗氧化活性实验评价结果显示,卷曲乳酸杆菌对氧化物质清除率为:DPPH 32.2%、OH 41.49%、O2-96.08%,对Fe2+的螯合能力约为86%以及总还原力测定OD700约为1.54,上述结果说明该菌株具有良好的体外抗氧化活性;（4）卷曲乳酸杆菌能显著抑制生殖道致病菌的生长,平均抑菌圈直径＞1.5cm,说明该菌株具有良好的抑菌特性;（5）细胞黏附实验结果显示,VK2/E6E7（永生化人阴道上皮细胞株）细胞黏附的卷曲乳酸杆菌约为7000 CFU/100 cells,这种黏附作用对于VK2/E6E7细胞的生长无显著的影响,说明该菌株具有较强的粘附性。2.卷曲乳酸杆菌对CE雌鼠的作用效果及机制探究（1）造模第3周,雌鼠子宫内膜组织中大量淋巴细胞及浆细胞浸润,并伴有子宫内膜组织结构改变,符合CE的组织病理学改变,表明本课题中造模的方式成功构建了CE模型,可用于后续的相关研究;（2）与M组相比,卷曲乳酸杆菌有效降低了子宫内膜组织炎症反应,子宫内膜间质中淋巴细胞及浆细胞浸润明显减少,并逆转了子宫内膜的组织病理学损伤。说明卷曲乳酸杆菌可有效改善CE的表型,并与抗生素有协同作用,可促进子宫内膜的修复;（3）与M组相比,L组及L+Abx组子宫内膜组织中炎症蛋白TLR4、p-p65/p65、My D88的表达水平显著下调（p＜0.01）,促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8明显减少（p＜0.01）,说明卷曲乳酸杆菌可通过抑制炎症通路信号蛋白的表达,显著降低CE雌鼠子宫内膜组织的炎症反应;（4）与M组雌鼠子宫内膜中致病菌丰度增高相比,Abx组、L组及L+Abx组雌鼠子宫内膜中致病菌的丰度显著下降（p＜0.01）,L组（p＜0.05）及L+Abx组（p＜0.01）子宫内膜中乳酸杆菌的丰度显著增高。3.卷曲乳酸杆菌对CE雌鼠胚胎着床的影响及潜在机制（1）M组未观察到受孕及胚胎着床,而L组及L+Abx组受孕率均为100%,平均着床数为L组7个,L+Abx组10个。上述结果表明阴道卷曲乳酸杆菌可有效提高CE雌鼠的受孕率及胚胎着床数量;（2）相较于C组,CIM组中VEGF、MMP9的表达显著增加,而M组中表达量显著减少（p＜0.01）,卷曲乳酸杆菌干预使L组及L+Abx组中VEGF和MMP9的表达上调,其表达水平与CIM组接近,说明该卷曲乳酸杆菌可有效增加着床相关细胞因子的表达,促进胚胎着床;（3）着床相关因子VEGF、IHH、BMP2、Wnt4、HGF、CSF、IGF、EGF在CIM组雌鼠子宫内膜中转录水平的表达增加,M组中的表达受到不同程度的抑制,卷曲乳酸杆菌或联合抗生素治疗促进了着床相关因子转录水平的表达,其中BMP2、Wnt4转录水平的表达在各组中差异最显著（p＜0.01）,说明该菌株可能通过影响着床相关通路信号蛋白或分子的表达,发挥促进胚胎着床的作用;（4）Western-blot检测结果显示,M组中Wnt/β-catenin经典信号通路上相关信号分子Wnt4、BMP2、β-catenin的表达被显著抑制,而在L组及L+Abx组中上述蛋白的表达显著增加（p＜0.05）,说明卷曲乳酸杆菌促进胚胎着床的作用可能是通过激活Wnt/β-catenin经典信号通路来实现的。结论:综上所述,本课题研究结果证实阴道卷曲乳酸杆菌具有良好的体外益生性质,并可以显著抑制生殖道常见致病菌的生长。该阴道卷曲乳酸杆菌可通过抑制炎症通路信号蛋白的表达,降低CE雌鼠子宫内膜组织的炎症反应,有效改善CE雌鼠的组织病理学表型,同时通过在子宫内膜中定植,抑制子宫内膜中病原菌的生长。另外,该菌株可能通过激活Wnt/β-catenin经典信号通路,调控子宫内膜蜕膜化,增加子宫内膜容受性,调节胚胎植入,进而增加CE雌鼠的受孕率并促进胚胎着床。本研究为临床治疗CE以及改善妊娠结局提供了新的思路,为后续卷曲乳酸杆菌的临床应用提供了数据支持。