研究背景与目的：胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，化疗效果常欠佳，其中重要原因是产生了耐药性。耐药性的产生大大降低了抗肿瘤药物的疗效，是肿瘤化疗失败的主要原因。已知耐药机制涉及多药耐药基因的上调，药物靶酶活性改变等，但仍难以解释临床耐药的复杂性。最近研究显示端粒酶和核因子-kappa B(NF-κB)可能在耐药形成中发挥重要作用。端粒酶是一种逆转录核糖核蛋白酶，能合成端粒片段并加到染色体末端，维持染色体的稳定并促进细胞增殖和永生化。端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的组分之一，被认为是激活端粒酶的限速酶。端粒酶在大多数人类肿瘤中高表达，而体细胞中表达极低甚至缺如，因此它成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。人们发现端粒酶活性的高低可能与肿瘤的恶性程度相关，而且端粒酶活性高的肿瘤组织和细胞对化疗治疗的反应较差，提示端粒酶活性与化疗敏感性之间存在一定关系。NF-κB(通常指p50／p65二聚体)是一种重要的核转录因子。静息时它与细胞内抑制物IκB结合，活化时IκB降解，受其抑制的NF-κB释放，进入细胞核，与靶基因结合并调节其转录活性。最近发现NF-κB参与促进肿瘤的发生发展，在许多恶性肿瘤中都有激活。它还可通过在转录水平上调抗凋亡基因的表达，来阻止化疗和放疗诱导的肿瘤细胞死亡。序列分析表明hTERT启动子包含Sp1、AP-2等多个转录因子结合位点，研究也证实hTERT主要在转录水平受到调节，而NF-κB作为一种重要的转录调节因子，是否能调节hTERT的表达，进而影响端粒酶的活性，这是一个令人感兴趣的问题。目前在胃癌长春新碱(Vincristine，VCR)耐药形成机制中，缺乏对端粒酶和NF-κB作用的研究。本实验以胃癌细胞系SGC7901及其长春新碱耐药株SGC7901／VCR为研究对象，检测端粒酶和NF-κB基础活性及VCR诱导后的活性变化，以及hTERT蛋白、NF-κB亚单位p65、IκB-α蛋白的相应改变，以探讨端粒酶和NF-κB活化是否参与胃癌细胞对长春新碱的耐药，以及端粒酶活化是否由NF-κB信号转导途径介导。在耐药逆转剂方面，目前研究最多的是细胞膜P-糖蛋白抑制剂，虽然体外逆转效果较好，但因毒副作用大限制了临床应用。人们开始着眼于耐药形成的分子机制，即以酶、受体、基因为靶点寻找新的逆转剂。在耐药逆转领域，对NF-κB抑制剂的研究刚开始，尚无端粒酶抑制剂与耐药逆转的研究资料，所以本实验还观察了NF一忍抑制剂MG一1犯和端粒酶抑制剂AZT对VCR耐药性的影响，为胃癌耐药逆转提供新思路。 方法:(l)常规方法培养胃腺癌细胞SGC7901和相应长春新碱耐药细胞sGC7901/V CR。接种后培养36一40h再加药，设VCR组、MG一132组(2.5林M MG一132预处理细胞3omin)、厄T组(100林MAZT预处理细胞gomin)及不加药物的空白对照组和DMSO溶剂组。(2)MTT法检测SGC7901和SGC7901阿CR细胞对VCR(终浓度为10一102m留L，作用72h)的敏感性，以及在MG一132或AzT存在时，两种细胞对VCR敏感性的变化，细胞存活率(%)二(实验孔A值/对照孔A值)x100%;耐药倍数(Rl)二IC5o(SGC7901/V CR)八CS。(SGC7901)。(3)TRAP一ELISA法检测两种细胞的端粒酶活性，以吸光度值胡表示，端粒酶活性抑制率二1一抑制剂组胡戊CR组胡。(4)凝胶电泳迁移率分析(Eleetrophoretie mobility shift assav， EMSA)法检测敏感和耐药细胞的NF一出DNA结合活性，显影带通过激光扫描仪扫描成像，用Imagequant软件分析各带的相对放射性强度。(5)细胞酶联免疫吸附法 (CelkioELIsA)测定两种细胞IKB一a蛋白的表达，倒置显微镜下计数每孔细胞数，使吸光度值标准化。(6)免疫细胞化学法检测hTERT蛋白的表达和NF一妞p65核转位。 结果:(l)veR对SoC79ol和sGe79ol戊eR的xes。值分别为(0.26士0.06)mg/L和(4 0.03士5.82)m留L(尸<0.01)，RI为154.0倍。(2)两种细胞均存在端粒酶基础活性;vCR可诱导酶活性增高，在一定范围内呈浓度依赖性。以5、10、20、50林g几vcR作用24h，除5林g几组外，其它浓度VCR作用下的耐药细胞酶活性均较敏感细胞高;10林g/L veR作用o、12、24、48、72h时，与同时段敏感细胞相比，耐药细胞的酶活性均更高(1.301一2.096倍)。10林g/L VCR处理不同时间后，耐药细胞胞核hTERT 蛋邮日性表达率显著高于敏感细胞(尸<0.01)。AZT可显著抑制耐药细胞的端粒酶活 性和hTERT蛋白阳性表达。(3) SGC7901/V CR耐药细胞中NF一KB的基础活性比敏 感细胞高1.4倍;vCR可诱导NF一KB活化，在一定范围内呈浓度依赖性。不同浓度 VCR作用6h均可引起耐药细胞NF一KB DNA结合活性增强、I妞一a蛋白表达下降， 而亲本敏感细胞产生的上述效应均不及耐药细胞明显;NF一KB活化的同时伴有p65 核转位。抑制剂MG一132可抑制vCR诱导的NF一KB活化、l沼心降解和P65核转位。 (4) vCR以不同浓度或不同作用时间处理时，两种细胞的NF一KB活化均先于端粒酶活性达峰值;NF一出抑制剂MG一1犯可明显抑制耐药细胞的基础端粒酶活性和VCR诱导的酶活性增高(抑制率为63.1%一91.0%)，并抑制hTERT蛋白高表达;而端粒酶抑制剂AZT对VCR诱导的NF一KB活化和p65核转位无明显影响。(5) MG一1犯、AZT及MG一132联合AZT预处理时，SGC一79