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随着分子生物学技术的不断发展，聚合酶链式反应(PCR)依靠其灵敏、快速和操作简单等优点逐渐成为早期胚胎性别鉴定的主流技术。应用该技术可以充分发挥公母畜各自的生产优势，提高育种效率。我国南方各省的水牛乳业资源丰富，发展潜力巨大，开展水牛早期胚胎性别鉴定研究工作的意义重大。但在性别鉴定的具体操作过程中，还存在着由于单一扩增雄性特有的性别决定基因(Sry)失败判定为阴性，双引物双重PCR扩增时由于Sry基因单拷贝而常染色体基因多重复导致Sry基因扩增不充分或未能扩增等问题。本研究采用双引物两步PCR对水牛血液白细胞进行性别鉴定，弥补单对引物扩增时出现假阴性、双引物双重PCR扩增时Sry基因不易扩增的不足，进一步提高性别鉴定的精确度，优化性别鉴定体系。应用该优化的性别鉴定体系对水牛早期16细胞胚胎性别鉴定的最适胚胎模板量进行了探讨，并对胚胎培养液中添加不同血清对水牛早期胚胎不同发育阶段性别比率的影响进行了初步研究。试验结果如下： 1．双引物两步PCR鉴定水牛血液白细胞性别研究：对引物设计的合理性和双引物两步PCR对性别鉴定的效果进行探讨，以期解决单对Sry基因引物扩增时易出现假阴性、双引物双重PCR扩增时Sry基因不易扩增的问题，优化性别鉴定体系。 (1) 引物设计及其合理性检测：根据NCBI基因数据库中公布的公水牛特有的Y染色体性别决定基因(Sry)序列和公、母水牛共有的常染色体1.715卫星DNA序列，应用Primer 5.0引物设计软件自主设计了两对引物S1／S2、B1／B2。S1／S2引物用于Sry基因体外扩增，B1／B2引物用于1.715卫星DNA序列体外扩增。应用所设计的两对引物分别对公母水牛血液白细胞基因组进行体外扩增，结果显示，第一对引物S1／S2能够有效的对公水牛血液白细胞基因组Sry基因进行扩增，而对母水牛血液白细胞基因组则无相应的扩增产物。扩增产物长度为350bp，与所设计引物的理论扩增值相符。第二对引物B1／B2在对公母水牛血液白细胞基因组1.715卫星DNA序列进行体外扩增时，均有长度为149bp扩增产物出现，也与所设计引物的理论扩增值相符。 试验结果表明：所设计的两对引物能够有效的对公水牛特有的Sry基因和公母水牛共有的1.715卫星DNA序列进行体外扩增，可应用于性别鉴定体系。 (2) 双引物双重PCR鉴定水牛血液白细胞性别研究：为了杜绝单一Sry基因扩增失败或胚胎丢失导致的假阴性现象，本试验应用双引物双重PCR对公水牛血液白细胞进行性别鉴定。同时扩增出两条特异扩增带的判定为雄性。结果显示，全部10份血样均成功扩增出1.715卫星DNA序列(149bp)，但只有3份血样扩增出Sry基因(350bp)，准确率为30.00％(3／10)。