研究背景安胃疡胶囊是惠州市九惠制药股份有限公司的拳头产品,是国家中药保护品种,国家医保品种,是由甘草黄酮制成的五类新药(原二类)。该药荣获“国家级新产品”、“广东省优秀新产品”、“广东省科技进步奖三等奖”、“惠州市惠城区科学技术进步二等奖”称号,是广东省第一个得到国家发改委支持的中药高技术产业化示范工程项目(项目名称为《安胃疡及甘草黄酮高技术产业化示范工程》),2000年获国家科技部“科技型中小企业技术创新基金”。药效学研究证明,本品能有效抑制胃液和胃蛋白酶的分泌,明显抑制胃液游离酸和总酸,降低胃酸浓度,修复胃及十二指肠溃疡粘膜,促进溃疡的愈合。对多种实验性溃疡模型有确切抗溃疡作用。临床研究表明安胃疡胶囊对慢性浅表性胃炎总有效率为91.83%。安胃疡胶囊的原料是甘草黄酮,存在着口服剂量大,溶解性较差,生物利用度低,日服用次数偏多等缺点。在提取工艺方面,采用酸碱法提取甘草渣中的甘草黄酮,方法复杂,环节多,质量不稳定。在质量标准方面,目前仍然是用重量法来测定总黄酮含量,质量控制方法粗糙,无法反映整体质量,质量标准无法与国际接轨,作为一个名优中成药的内涵还未得到充分展示,缺乏知识产权保护。目的本课题主要是对安胃疡胶囊的原料甘草渣制定准确、灵敏、简单的质量标准,从基源上开始控制安胃疡胶囊的质量,使其生产和质量稳定安全可控。同时采用生物酶解技术联合醇提法对甘草渣中的黄酮类成分进行提取后采用大孔吸附树脂进行分离纯化代替之前的醇提-碱溶酸沉法,节省成本,降低对环境的污染,在此基础上对精制后的黄酮类成分采用波长切换技术建立HPLC指纹图谱技术对安胃疡的质量标准进行新的提高,使其能够真正反映安胃疡内在的整体质量。方法1.安胃疡中总黄酮的含量测定研究为选择能够较为准确反映安胃疡中甘草黄酮含量的标准品,采用以甘草苷、甘草素、甘草查尔酮A、柚皮苷等对照品的碱性比色法和以芦丁为对照品的硝酸铝比色法,将供试品与对照品进行相同的显色方式处理后,采用紫外检测在200～600nm处进行全波长扫描,确定合适的对照品。2.安胃疡原料的质量标准研究在《中国药典》2010版甘草项下薄层鉴别,含量测定和一般检查项的基础上,对安胃疡的原料药材甘草渣进行质量标准的修订。鉴别项以甘草酸铵为对照品,甘草和胀果甘草为对照药材进行薄层色谱鉴别;含量测定项包括采用高效液相色谱法测定甘草渣中甘草酸铵和甘草苷的含量以及采用紫外分光光度法测定甘草渣中总黄酮的含量。同时对一般检查项中的水分、总灰分、酸不溶性灰分亦进行了测定。3.安胃疡提取工艺优化研究采用生物酶解技术联合醇提法对安胃疡原料药材甘草渣中黄酮类物质提取进行研究,以甘草渣中总黄酮含量为指标,甘草苷为对照品的碱性比色法,采用紫外分光光度法测定总黄酮含量,通过对酶品种、加水量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值等进行单因素筛选优化酶解工艺,同时为了考察这些因素对提取的协同作用,在单因素试验优化基础上,选用对酶解影响较大的3个因素,各取3个水平,进行L9(34)正交试验优化,筛选出酶解甘草渣的最优工艺。在酶解基础上,对影响乙醇提取法影响较大的提取方法、醇提时间、醇提浓度、乙醇体积、醇提温度、提取次数等进行单因素筛选,再采用正交试验法对醇提工艺进行优化,确定最佳醇提工艺。4.安胃疡精制工艺优化研究以酶解醇提甘草渣得到的浓缩液为研究对象,以浸膏得率和甘草总黄酮纯度为指标,对 D101、X-5、AB-8、S-8、D301、NKA-2、NKA-9 7 种大孔吸附树脂采用静态吸附试验进行筛选。采用AB-8大孔树脂进行动态吸附条件的筛选,单因素筛选对包括药液pH值、上样质量浓度、上样流速、径高比等在内的吸附条件以及包括水洗除杂体积、洗脱液浓度、洗脱液pH值、洗脱体积、洗脱流速等在内的洗脱条件进行筛选,并在单因素试验的基础上,采用L9(34)正交试验分别对吸附条件和洗脱条件进行优化,以筛选最优的吸附洗脱条件。5.HPLC法建立安胃疡黄酮类成分的指纹图谱采用高效液相色谱法波长切换技术建立安胃疡原料药材甘草渣和安胃疡浸膏粉的指纹图谱,指认出其中的甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素、甘草查尔酮A和甘草酸铵等物质,并在此基础上建立安胃疡原料药材以及浸膏中甘草黄酮类物质的的指纹图谱。结果1.安胃疡总黄酮的含量测定研究为了选择适宜的对照品,建立能够准确测定安胃疡胶囊中甘草总黄酮含量的方法。针对甘草苷、甘草素、甘草查尔酮A、柚皮苷和供试品溶液采用10%KOH溶液进行显色后全波长扫描,发现甘草苷和样品溶液的最大吸收波长在337nm处,且全波长扫描后得到峰形基本一致,而甘草素、柚皮苷均是在440nm左右处有最大吸收波长,甘草查尔酮A则在410nm有最大吸收波长,芦丁对照品和样品经Al2(N03)3-NaOH-NaN02显色后最大吸收波长分别为510nm和363nm。所以选用甘草苷为对照品应用于紫外分光光度法测定甘草总黄酮成分准确度较高,是切实可行的含量测定方法。2.安胃疡原料的质量标准研究结合《中国药典》2010版一部甘草项下的薄层鉴别项、含量测定和一般常规检查项目,对安胃疡原料甘草渣的性状进行描述,鉴别项以甘草酸鞍为对照品,甘草和胀果甘草为对照药材,采用10%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂,显色剂为10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)下检视,结果供试品在与甘草酸铵相对应的位置并没有斑点出现,与甘草对照药材和胀果对照药材显相同颜色的荧光斑点。一般项目检查包括水分、灰分以及酸不溶性灰分、水分。水分含量约为7.66%,灰分约为7.94%,其限度规定为甘草渣中灰分含量不得高于8.3%,酸不溶性灰分在2.17%左右,其限度规定为甘草渣中酸不溶性灰分含量不得高于2.5%。含量测定主要包括对甘草总黄酮的测定以及甘草渣中甘草苷和甘草酸铵的含量测定。总黄酮的测定是以甘草苷为对照品,10%KOH溶液作为显色剂,在波长337nm处进行测定,建立了测定甘草渣中总黄酮含量的紫外分光光度法,并应用此方法对5批甘草渣进行了含量测定,表明甘草苷回归方程为:y=5.462x-0.0083(r=0.9997),其在 0.00184～0.0092 mg.mL-1 浓度范围内线性关系良好,同时进行了相应的方法学考察。5份样品的平均含量为1.81%,限度范围为甘草渣中总黄酮含量不得低于1.45%。采用HPLC法对甘草渣中甘草苷和甘草酸铵的含量进行测定,采用超声处理样品,以乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱,流速为0.7mL.min-1,检测波长为237nm,柱温25℃。结果回归方程分别为:y甘草苷=14314x+31.44(r=0.9992);y甘草酸铵=3892.9x+21.473(r=1)。结果表明,甘草苷在0.222～1.11mg.mL-1浓度范围内,甘草酸铵在0.36～2.16 mg·mL-1浓度范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系。甘草苷和甘草酸铵的回收率分别为100.74%和99.34%,RSD分别为1.38%和2.50%,不同批次甘草苷含量在0.1180～0.3973mg·g-1之间,平均含量为0.019%,甘草酸铵的含量在5.0568～6.3628 mg·g-1之间,平均含量约为0.57%,求出平均值后下调20%,得出甘草渣中甘草苷的含量不得低于0.015%,甘草酸铵的含量不得低于0.46%。3.安胃疡提取工艺优化研究本研究在乙醇提取之前,通过单因素筛选和正交试验对安胃疡的酶解工艺参数进行了优化,并在此基础上进一步优化了醇提工艺参数。实验结果表明,酶辅助提取最佳的工艺条件为:采用1g纤维素酶和10倍量的水50℃水浴酶解90min。在确定的酶解条件下进行醇提工艺的优化,结果表明,醇提的最优工艺为:采用10倍量80%乙醇80℃水浴加热回流90min提取两次,得到的浸膏中总黄酮收率为4.40%,较超声单一醇提的收率提高了 1.43倍。4.安胃疡精制工艺优化研究通过7种大孔吸附树脂对安胃疡中甘草黄酮的静态吸附试验,筛选出最佳树脂。结果表明:AB-8大孔树脂对甘草渣总黄酮的吸附性能最好,吸附率和解吸率分别为67.90%和65.36%。AB-8大孔树脂对甘草渣总黄酮吸附的最佳条件为:径高比为1:10、上样量为20mL、药液pH值为5.0、药液质量浓度为2.Omg·mL-1、吸附流速为2.0mL·min-1。而在此吸附条件的基础上,解吸附的最佳条件是先采用蒸馏水40mL洗大孔树脂柱至流出液澄清,再采用pH值为10.0的70%乙醇100mL以1.0mL·min-1的流速进行洗脱。通过本工艺得到的甘草黄酮得率为4.98%,纯度达56.83%。说明采用AB-8大孔树脂对甘草黄酮进行纯化的工艺可行。5.HPLC法建立安胃疡黄酮类成分的指纹图谱采用高效液相色谱波长切换技术建立安胃疡原料药材甘草渣和安胃疡浸膏粉中甘草总黄酮类物质采用计算机软件对色谱峰数据进行评价,建立了安胃疡甘草黄酮类成分的HPLC指纹图谱。结果表明,主要峰群的整体图貌基本一致,其中指认了甘草苷、甘草素、甘草查尔酮A、异甘草苷、异甘草素等物质,制定了安胃疡中甘草黄酮类化合物的指纹图谱。通过建立甘草黄酮类成分的指纹图谱,可利用其特征峰有效地建立以反映安胃疡及其制剂整体化学特征的科学、合理、可行的安胃疡质量控制新方法。结论1.采用甘草苷为对照品应用于紫外分光光度法中测定安胃疡中甘草总黄酮的含量准确度较高,是切实可行的含量测定方法。2.在安胃疡原料的质量标准研究中,对甘草渣进行水分,灰分和酸不溶性灰分的限度测定,薄层鉴别,含量测定等方面的研究。含量测定包括高效液相色谱法测定甘草酸铵和甘草苷的含量以及采用紫外分光光度法测定甘草总黄酮的含量,方法简单可行,为建立安胃疡中黄酮类成分的质量标准提供理论依据。3.在甘草渣中总黄酮提取工艺研究中采用酶解联合乙醇提取法对甘草渣中的总黄酮进行提取,甘草总黄酮收率较超声单一醇提的收率提高了 143.09%,说明采用酶法辅助提取甘草渣中黄酮类物质,可以明显提高总黄酮的提取率,方法简单可行,成本低廉。4.对酶解醇提得到的提取液采用大孔树脂进行精制纯化,结果为AB-8大孔树脂对甘草渣总黄酮的吸附性能最好,而通过本工艺得到的甘草黄酮得率为4.98%,纯度达36.83%。这说明AB-8大孔树脂纯化安胃疡中的甘草黄酮效果较好,工艺的重复性和稳定性良好,适于工业化生产。5.以精制后得到的浸膏为原料,采用高效液相色谱波长切换技术建立安胃疡甘草黄酮类物质一测多评含量测定方法,通过建立的甘草黄酮类成分的指纹图谱,可利用其特征峰有效地建立反映安胃疡及其制剂整体化学特征的科学、合理、可行的安胃疡质量控制新方法。