研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)被世界卫生组织(WHO)定位星形细胞瘤IV级,是成人中枢系统中最常见的最具侵袭性的原发性恶性肿瘤,占所有胶质瘤发病率的54%。目前,胶质母细胞瘤的主要治疗手段是手术切除、术后放疗和术后化疗的联合治疗方法。虽然人们在胶质母细胞瘤具体治疗方法上取得了一定改善,但总体疗效收效甚微,胶质母细胞瘤的中位生存期仅为12～14个月,5年生存率不到5%。因此,急需更加有效的治疗手段来改善胶质母细胞瘤的治疗现状。信号转导与转录激活因子3(signal Transducers and Activators of Transcription, STAT3)是细胞因子/生长因子信号传导中重要的胞质转录因子,在调节细胞生长、生存、分化和凋亡中发挥着重要作用。STAT3在包括胶质母细胞瘤在内的许多种恶性肿瘤中表现为迷乱的活化状态。研究表明阻断STAT3持续的活化状态可以有效抑制恶性肿瘤细胞的增殖和存活,诱导恶性肿瘤细胞凋亡,而且对人体正常的细胞影响较小。因此,可能成为治疗恶性肿瘤的有效治疗方法。Cucurbitacin Ⅰ (JSI-124)是从葫芦科和十字科植物中提取的天然三菇类化合物,是JAK2/STAT3的选择性阻断剂,具有很好穿透细胞膜和酪氨酸激酶抑制的功能。大量的研究表明Cucurbitacin Ⅰ对许多种恶性肿瘤细胞(乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤及恶性胶质瘤)具有潜在的抗癌活性。但是,人们对Cucurbitacin Ⅰ治疗胶质母细胞瘤的机制并未完全阐明。巨自噬(亦称为自噬)是一种分解代谢的过程。自噬发生时,包括细胞器在内的胞浆内容物被双层膜(自噬体)包裹,接着与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而将内容物降解为可重复利用的小分子蛋白、多肽和氨基酸。在细胞应激状态下,如饥饿、缺血、缺氧、放射线照射、化疗等,自噬能够增强细胞生存能力。大量研究表明,应用自噬抑制剂(Chloroquine、Hydroxychloroquine、bafilomycinA1、 monensin等)或敲除主要自噬相关基因(Beclin1、Atg5、Atg12等)抑制自噬后能够增强许多抗癌制剂杀伤癌细胞能力,说明白噬在抗癌过程中对癌细胞起保护作用。本课题旨在从自噬、凋亡等方面对Cucurbitacin I治疗胶质母细胞瘤的具体机制进行系统的研究。目的研究Cucurbitacin I诱导胶质母细胞瘤凋亡和自噬的相关机制,为胶质母细胞瘤患者提供新的有效的治疗方法。方法一、体外1.CCK-8法检测不同时间点、不同浓度的Cucurbitacin I作用下的胶质母细胞瘤细胞株U251及T98G的细胞活力。2. Western blot法检测胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G胞内蛋白分子的表达水平。3.免疫荧光实时观测经GFP-LC3瞬时转染的胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G中GFP-LC3阳性细胞的表达水平。4.免疫荧光法观测胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G自噬蛋白分子LC3的表达水平。5.透射电镜观测胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G自噬体的表达水平。6. TUNEL法检测胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G的凋亡水平。7. ELISA法检测胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G的凋亡水平。8.免疫共沉淀法检测胶质母细胞瘤细胞株U251胞内Bcl-2和Beclin1/hVps34复合体相互作用。9. siRNA转染法沉默胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G中的beclin1基因。二、体内1.选用胶质母细胞瘤细胞株U251建立人胶质瘤荷瘤裸鼠异位模型。2.通过测量荷瘤鼠平均体重和肿瘤平均体积大小从而检测Cucurbitacin Ⅰ、氯喹及Cucurbitacin I联合氯喹对荷瘤鼠副作用以及对荷瘤鼠的治疗效果。3.免疫组化法检测肿瘤中LC3、Ki-67、Bax、Cleaved Caspase-3(p17)、Bcl-2以及Bcl-xL表达水平。4.TUNEL法检测肿瘤凋亡水平。结果一、Cucurbitacin I抑制GBM增殖在体外,CCK-8法显示与对照组相比,胶质母细胞瘤细胞株U251和T98G在Cucurbitacin I≥100nM作用下细胞活力下降明显,且呈剂量-时间依赖效应。在体内,对照组平均肿瘤体积为1286mm3(±251),Cucurbitacin I组平均肿瘤体积为412mm3(±82)；对照组和Cucurbitacin I组平均肿瘤重量分别是1,340mg (±260) and418mg (±80), Cucurbitacin I能有效抑制肿瘤体积和大小(P<0.05)。另外,免疫组化显示,Cucurbitacin I组Ki-67表达水平明显下降(P<0.001)。二、Cucurbitacin I诱导GBM发生凋亡在体外,TUNEL法检测显示,经Cucurbitacin I治疗的GBM细胞中TUNEL阳性细胞数较对照组显著性增加,且呈剂量依赖效应(P<0.001)。ELISA法表明,Cucurbitacin I组肿瘤细胞凋亡率较对照组显著性增加,亦呈剂量依赖效应(P<0.001)。不同浓度Cucurbitacin I作用于GBM细胞后western blot检测发现,凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3(p17)表达明显上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达明显下调,且均呈剂量依赖效应。另外,在体内,免疫组化检测发现肿瘤中Bax和Cleaved Caspase-3(p17)表达水平较对照组显著性上调,而Bcl-2和Bcl-xL表达较对照组显著性下调。诱导GBM发生自噬并激活自噬相关蛋白Cucurbitacin I三、beclin1透射电镜发现,经Cucurbitacin I治疗的GBM细胞中自噬体数量较对照组显著性增加(P<0.05)。免疫荧光发现经GFP-LC3瞬时转染的GBM细胞在Cucurbitacin I治疗后GFP-LC3阳性细胞数量较阴性对照组显著性增加,且呈浓度依赖效应。同样,免疫荧光法检测发现GBM细胞经Cucurbitacin I治疗后自噬蛋白LC3B阳性细胞数量较阴性对照组亦显著性增加,且呈剂量依赖效应。另外,western blot显示不同浓度Cucurbitacin I处理的GBM细胞中LC3B-II及Beclin1表达水平明显上调；bafilomycin A1使GBM细胞中LC3B-II/LC3B-Ⅰ表达上调,但bafilomycin A1联合Cucurbitacin Ⅰ后LC3B-II/LC3B-Ⅰ上调更为明显；Cucurbitacin Ⅰ治疗后GBM细胞中p62水平下调,bafilomycin A1治疗后GBM细胞中p62水平上调,而Cucurbitacin Ⅰ阻碍了bafilomycin A1对p62表达的上调。在体内,免疫组化检测发现Cucurbitacin Ⅰ组中LC3B表达水平较对照组显著性增强。四、Cucurbitacin Ⅰ激活GBM细胞中AMPK/mTOR/p70S6K信号通路Western blot检测发现,经不同浓度Cucurbitacin Ⅰ治疗的GBM细胞p-AKT及AKT表达水平不变,而使p-AMPK, p-mTOR以及p-p70S6K水平活化,且呈剂量依赖效应。五、Cucurbitacin Ⅰ激活GBM细胞中JAK2/STAT3/HIF-1α信号通路Western blot检测表明,不同浓度Cucurbitacin Ⅰ治疗的GBM细胞p-JAK2、 p-STAT3、HIF-1α表达水平下调,且呈剂量依赖效应。六、下调的HIF-1α在Cucurbitacin Ⅰ诱导GBM细胞自噬中发挥重要作用透射电镜和免疫荧光分别发现,HIF-1α稳定剂FG-4497显著降低Cucurbitacin Ⅰ诱导的GBM细胞自噬体数量增加和GFP-LC3阳性细胞数量增加(P<0.05)。Western blot检测表明,FG-4497显著增加GBM细胞HIF-1α水平,抑制了Cucurbitacin Ⅰ诱导的Bcl-2表达水平下调以及LC3B-I向LC3B-Ⅱ转化。敲除Beclin1以及给予自噬抑制剂3-MA能够阻碍Cucurbitacin Ⅰ诱导的LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化。免疫共沉淀显示对照组中Bcl-2和Beclin1/hVps34相互关联,而在Cucurbitacin Ⅰ治疗的GBM细胞中Bcl-2和Beclinl/hVps34关联显著性下降。七、抑制自噬能够增强Cucurbitacin Ⅰ诱导的GBM细胞凋亡CCK-8法检测表明,自噬抑制剂氯喹(CQ)显著性增强Cucurbitacin Ⅰ抑制GBM细胞增殖的能力(P<0.05)。ELISA法和TUNEL法检测发现氯喹(CQ)显著性增强Cucurbitacin Ⅰ诱导的GBM细胞凋亡。另外,SiRNA沉默GBM细胞beclin1表达后,能够显著增强Cucurbitacin Ⅰ抑制GBM细胞增殖的能力以及Cucurbitacin Ⅰ诱导的GBM细胞凋亡(P<0.05)。八、在人胶质瘤荷瘤裸鼠异位模型中,CQ增强Cucurbitacin Ⅰ对肿瘤生长的抑制作用实验终末阶段,测量的肿瘤平均体积大小分别是：对照组(DMSO),616mm3(±130)；CQ组,580mm3(±107); cucurbitacin Ⅰ组,346mm3(±79)；CQ联合cucurbitacin Ⅰ组,220mm3(±62)。CQ组与对照组相比无统计学差异,而cucurbitacin Ⅰ组与对照组、CQ联合cucurbitacin Ⅰ组与对照组以及CQ联合cucurbitacin Ⅰ组与cucurbitacin Ⅰ组相比差异性显著(P<0.05)。另外,CQ联合cucurbitacin Ⅰ组肿瘤平均瘤重与cucurbitacin Ⅰ组相比差异性显著(P<0.01)。平均荷瘤鼠体重在各组间无统计学差异(P>0.05)。最后,免疫组化检测发现,cucurbitacin Ⅰ组中Ki-67表达水平较对照组差异性显著(P<0.01):CQ联合cucurbitacin Ⅰ组中Ki-67表达水平较cucurbitacin Ⅰ组差异性显著(P<0.01)。TUNEL法检测表明,cucurbitacin Ⅰ组中TUNEL阳性细胞数较对照组差异性显著(P<0.01)；而CQ联合cucurbitacin Ⅰ组中TUNEL阳性细胞数较cucurbitacin Ⅰ组差异性显著(P<0.05)。结论一、Cucurbitacin Ⅰ在体外和体内均能有效抑制GBM增殖。二、Cucurbitacin Ⅰ通过调节bcl-2家族蛋白水平诱导GBM凋亡。三、Cucurbitacin Ⅰ通过激活AMPK/mTOR/p70S6K信号通路诱导GBM发生自噬。四、Cucurbitacin Ⅰ下调GBM细胞中HIF-1α和bc1-2水平并抑制Beclin1/hVps34复合体关联。五、在体外和体内,抑制自噬有效增强Cucurbitacin Ⅰ诱导的GBM细胞凋亡。