全面研究肿瘤发病机制及其生理特点,是提高开发新型肿瘤诊疗技术成功率的关键。三维肿瘤细胞球（three dimensional tumor spheroids,3D TS）在组织结构、细胞-细胞、细胞-微环境间的相互作用、代谢、基因/表型等方面与原发组织有很高的相似性,在生物学和生物医学研究中得到了越来越多的重视。目前,在肿瘤相关领域,三维肿瘤细胞球在癌症干细胞的富集、抗肿瘤药物的药效评估等方面展示了其独特的优势。而如何高效获得肿瘤细胞球,是深入研究及拓宽肿瘤球应用的关键。三维细胞支架（3D scaffold）能模拟细胞外基质的微结构,已成为肿瘤细胞球培养的优势方法之一。但是,无论是繁杂的湿化学反应,还是细胞毒性有机溶剂残留,或是使用更昂贵的机械设备均极大地限制了三维细胞支架在普通生物实验室的广泛应用。（类）纸基材料为三维支架法肿瘤细胞球培养平台的开发提供了新方向,归功于其天然多孔的纤维网架结构、独特的柔韧性、易于化学和物理修饰、成本低廉、生态友好性以及易于大规模生产等特点,已被用于构建纸基微流控芯片（microfluidic paper-based analytical devices）和纸基-水凝胶三维细胞培养（cells-in-gel-in-paper,Ci Gi P）等新兴方向。但是,目前已报道的纸基细胞培养模型种类单一、操作繁复,仅仅利用了其三维结构,但纸基理化性质对细胞生理行为的影响尚未进行深入探讨。因此,研究探讨调控纸基材料的理化性质培养3D肿瘤细胞模型以和对细胞行为的影响,进而基于改性纸基材料开发新型、高通量、低成本的三维肿瘤细胞球培养平台,对于疾病发病机制理解和诊疗技术的开发有着非常重要的意义。基于对上述相关领域和关键技术现状与挑战的分析,本论文首次研究了纸基材料理化性质对肿瘤细胞行为的影响,并探索了其作为肿瘤细胞球培养基材的潜力;在此基础上,利用生物材料对纸基进行改性,构建一系列基于（类）纸基的复合功能材料用于三维肿瘤细胞球培养,并深入探讨肿瘤细胞球形成机制。本文主要研究内容如下:1.探讨纸基材料理化性质对肿瘤细胞生物行为的影响在设计和选择用于组织工程和体外组织模型的生物材料时,其控制细胞反应的能力至关重要。生物材料表面的理化性质密切影响细胞的生物反应,包括细胞黏附、生存、周期进程和表型。纸基材料因其天然多孔纤维网架结构、独特的柔韧性、生态友好性等特点在体外细胞培养和原位生物分析领域崭露头角,但是纸基材料的理化性质对细胞的生物行为的影响还缺乏系统的研究。本工作以Whatman（?）114滤纸和中国宣纸为例,系统研究了纸基材料对前列腺癌细胞生物反应（行为）的影响。研究结果表明,具有相似三维纤维网络结构的滤纸和宣纸在纤维亚结构、亲疏水性、元素组成及价态上存在显著差异。更重要的是,前列腺癌细胞在超亲水滤纸的纤维间微壁龛中自发聚集形成肿瘤细胞球,而在光滑的中等亲水表面呈现沿纤维轴向伸长贴壁生长。该研究表明,在三维细胞培养中,纸基材料具有双功能性,不仅可以为细胞提供三维网络生长框架,而且可以通过其理化性质影响细胞行为,为将来基于纸基材料设计低成本三维肿瘤细胞球培养平台提供了理论指导依据2.基于亲水滤纸的肿瘤球培养及癌症干细胞的富集与分离癌症干细胞（cancer stem cells,CSCs）在肿瘤侵袭,转移和复发中起关键作用。然而,由于肿瘤组织中癌症干细胞的数量极少,分离、富集和培养癌症干细胞仍是是一项艰巨的工作。近来,研究发现肿瘤细胞球是CSCs富集和筛选的有效工具,已利用肿瘤球实现了乳腺癌、神经胶质癌和前列腺癌中CSCs的富集。我们推测亲水滤纸微壁龛中自发聚集形成肿瘤细胞球能富集高表达癌症干细胞标志物的细胞。定量PCR结果显示,与传统组织培养板上培养的细胞相比,滤纸上形成的前列腺癌细胞球中CSC特异生物标志物ALDH1 A1、OCT4、SOX2和NANOG的表达显著提高,说明肿瘤细胞球中细胞具有更强的自我更新能力,保持了细胞多向性。流式分选结果表明具有ALDH1A1+、CD44+和CD133+表型的癌症干细胞比例明显增加。此外,抗肿瘤药物测试结果显示滤纸上培养的前列腺癌细胞对化疗药物阿霉素具有更强的耐受能力。该研究表明,超亲水滤纸上自发形成的肿瘤球中含有更高比例的癌症干细胞,在癌症干细胞富集与分离、抗肿瘤药物评估等生物医学应用方面具有较好的应用前景。3.丝素蛋白@宣纸复合纤维支架的制备及其在肿瘤细胞球培养中的应用丝素蛋白（silk fibron,SF）具有良好的生物相容性和机械性能,是组织工程中极具吸引力的生物材料。近来,具有“千年寿纸”之称的中国宣纸（rice paper,RP）因其良好的生物相容性和低廉的价格吸引了众多研究者的关注,成为体外细胞球培养平台的潜力基材。本工作提出构建一种丝素@宣纸复合三维材料,通过调节复合材料的表面功能基团,促进肿瘤球的形成。首先,通过浸涂法在宣纸表面包覆一层褶皱状丝素蛋白膜,成功制备了核壳型丝素蛋白@宣纸（SF@RP）复合纤维支架。通过红外光谱分析结果,发现SF@RP复合支架表面的丝素蛋白的二级构象决定了细胞黏附特征,α-helical/random构象占优势的SF@RP复合支架能够诱导肿瘤细胞聚集形成三维细胞球。进一步研究发现,SF@RP复合支架表面富集的富集负电荷辅助细胞聚集。该SF@RP复合支架成功应用于乳腺癌、肺癌、前列腺癌等肿瘤细胞的体外培养,获得了多种肿瘤的肿瘤球。此外,对肝癌Hep G2肿瘤球的毒素代谢、蛋白分泌和化疗药物抗性等生理特性进行了研究。结果表明,与Hep G2单层细胞相比,SF@RP支架上形成的Hep G2细胞球种中与肝脏细胞代谢的CYP 3A4、CYP 1A1、Albumin基因表达水平显著提高,并展现出更高的药物耐受性。本工作开发了一种通过纸基材料表面化学改性来诱导肿瘤细胞球形成的新策略。同时,展示了一种简单、高效的核壳型纤维支架的制备方法。4.即用型多孔明胶@（类）纸基复合材料的制备及其在癌症干细胞富集中的应用细胞与微纳形貌的相互作用被证明是控制细胞生物行为或功能的重要信号源。研究人员通过在二维平面上雕刻的凹槽、格栅或微柱阵列研究了拓扑形貌对细胞行为的影响。但是,三维培养环境中拓扑形貌对细胞行为的影响还知之甚少。本工作采用液氮速冻/冷冻干燥法在擦镜纸和无纺布等类纸材料表面包覆一层蜂窝多孔状的明胶,成功制备了多孔明胶@类纸基复合支架。通过调控明胶的浓度和预冷温度制备出不同孔径的明胶@类纸基复合材料。体外细胞培养实验发现,当孔径小于细胞直径时,细胞趋向于聚集形成细胞球。与组织培养板上培养的细胞相比,肿瘤细胞球中的细胞具有更强的迁移能力。定量PCR、免疫印迹（Western blot,WB）结果表明,复合支架上形成的肿瘤细胞球中癌症干细胞标志物的表达显著增加。综合生物分析结果可知,明胶@（类）纸基复合材料可实现癌症干细胞富集。更为重要的是,存放了90天的明胶@（类）纸基复合材料依然能诱导细胞聚集形成肿瘤细胞球,展示了其作为即用型细胞培养基材的潜力。通过明胶@（类）纸基复合材料上形成肿瘤细胞球的机制分析,证实了材料表面形貌对细胞生物行为的重要影响。