日本血吸虫抗体的电化学与化学发光免疫传感器研究

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日本血吸虫病是一种能够给人类造成很大危害的寄生虫病。这种寄生虫病在非洲、亚洲和拉丁美洲的大部分地区广泛流行,严重威胁着广大疫区人民的生命财产安全。80年代中期,血吸虫病的防治策略由消灭媒介螺转向以化疗为主的综合性防治,由此血吸虫病的诊断工作显得愈加重要。近年来发展的一些诊断方法学实验,如对流免疫电泳(CIE)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接荧光免疫实验(IFIA)、放射免疫测定(RIA)等已经广泛的用于临床检测。这些方法大多复杂、耗时,而且需要昂贵的仪器设备或者放射性化学物质。所以,开发简单、灵敏、和低消耗的日本血吸虫病的检测方法依然是重要和必须的。本论文分别研究了运用电化学和化学发光免疫分析方法来检测日本血吸虫抗体,并将酶催化金属沉积技术应用到日本血吸虫抗体的电化学免疫检测中。主要研究工作简述如下:第一部分,将酶催化金属沉积应用到日本血吸虫抗体的电化学检测中。将日本血吸虫抗原通过戊二醛交联法固定在电极上,捕获日本血吸虫抗体,最后接联上碱性磷酸酶(ALP)标记的二抗形成三明治夹心的模型。在完成以上步骤后,将电极浸泡在底物缓冲液中。在碱性磷酸酶的作用下,非还原性的抗坏血酸2-磷酸(AA-P)转化成抗坏血酸(AA)。溶液中的银离子在抗坏血酸的作用下,被还原成银,从而使得银颗粒沉积在电极表面,再通过电化学方法检测。在本实验中优化了电极上抗原固定浓度,以及酶催化金属沉积的时间,检查了传感器对人体中其他蛋白质的抗干扰能力,取得了良好的效果。扫出峰电流与日本血吸虫抗体稀释比的对数在1:5000~1:100范围内呈线性关系。检测下限稀释比为1:6457。通过对感染不同天数的兔血清以及正常兔血清的测定表明了本方法在日本血吸虫病的临床检测方向有一定的应用前景。第二部分,通过化学发光方法检测日本血吸虫抗体浓度。将日本血吸虫抗原通过N-(3-二甲基氨丙基)-N-乙基碳二亚胺盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)固定在磁性纳米粒子的表面,用其捕捉日本血吸虫抗体,再与标记了辣根过氧化物酶(HRP)的二抗联结形成夹心复合物。分离洗涤后测量化学发光的强度,灵敏的测定样品中的日本血吸虫抗体含量。实验中对免疫反应的实验条件(如:日本血吸虫抗原在磁性纳米粒子表面的修饰浓度、修饰后磁性纳米粒子的用量以及抗原与待测抗体的反应时间等)进行了优化。此外,对人体中其他蛋白质的测定结果表明:该分析方法的抗干扰性也非常好。发光强度与感染兔血清的稀释比在1:10000~1:100的范围内成良好的线性关系,检测下限为1:13442。第三部分,将辣根过氧化物酶(HRP)对H2O2的催化特性应用到血吸虫抗体的电化学免疫检测中。实验通过夹心法的模式在电极表面固定了日本血吸虫抗原(SjAg)——日本血吸虫抗体(SjAb)——辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG的生物复合膜。计时电流法检测HRP酶催化H2O2还原对苯二酚底物产生的电流变化大小与日本血吸虫抗体(SjAb)浓度在一定范围内成正比。对免疫反应的实验条件(如:电极表面固定抗原的浓度、HRP酶标二抗的浓度)进行了优化。此外,考察了其他蛋白质对测定结果的影响。结果表明,该方法步骤简单,灵敏度低,线性范围宽,抗干扰性好。
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