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1研究背景放射治疗是胸部恶性肿瘤常用的治疗手段之一,肺是对射线中度敏感的器官,接受放射治疗后不可避免的会对正常肺组织造成一定的损伤,包括早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纤维化。放射性肺炎的主要临床表现有:咳嗽、咯痰、胸痛、发热、乏力等。目前,关于放射性肺炎的发病机制尚不明确,存在多种假说,有靶细胞学说、细胞因子级联学说、自由基学说等。放射性肺炎的治疗常用的有糖皮质激素、ACEI类、抗氧化剂、其他药物疗法及干细胞疗法等。近年来有学者研究证实自噬作为细胞的一种自我保护性机制,可以减轻射线对于正常组织的损伤,因此自噬在放射性肺炎中可能会起到一定的作用。中医学认为,放射线属于火热毒邪。本病的病机在于热毒、阴虚、血瘀、气虚等,往往相兼出现。导师多年的临床经验认为,本病早期主要是热毒伤阴为主,应以清热养阴为治疗原则,常用临床经验方“清肺益阴方”加减防治放射性肺炎,取得了较好的临床疗效。本研究以放射性肺炎大鼠为研究对象,围绕AMPK介导的自噬通路,对导师经验方“清肺益阴方”防治放射性肺炎的机制进行初步探讨。2研究目的通过观察中药“清肺益阴方”对放射性肺炎大鼠肺组织病理形态、肺系数、肺泡灌洗液中炎性因子的表达、自噬小体及自噬相关蛋白表达量的影响,探讨本方在防治放射性肺炎的起效机制,为指导临床用药治疗提供一定的理论依据。3研究方法3.1放射性肺炎大鼠模型的建立将大鼠用10%的水合氯醛按3ml/kg腹腔注射麻醉,平躺,四肢固定于自制木架,充分暴露胸部,用6MV-X线加速器,单次全胸照射16Gy,照射面积约为3.5cm X4.0cm(上至两腋窝、下至胸骨剑突,其余部分用10cm厚铅砖屏蔽),源靶距为100cm,剂量率250cGy/min。空白组大鼠在同等条件下肺部假照射OGy,实验组大鼠正常剂量全胸照射。3.2动物给药方法各组大鼠于照射后一天开始给药,每日1次,持续28d。每周称重三次,并根据体重情况调整给药剂量,按1ml/l00g给药。空白组:生理盐水,1次/日灌胃;模型组:生理盐水,1次/日灌胃;中药组:107g/kg/d生药药液,1次/日灌胃;激素组:1-2周给予1.25mg/kg/d,第三周给予0.625mg/kg/d醋酸泼尼松龙水溶液灌胃给药,第4周给予生理盐水1次/日灌胃;中药加激素组:1-2周予中药+激素药液(10.7g生药+1.25mg泼尼松/kg/d),1次/日灌胃;3周起予中药+激素药液(10.7g 生药+0.625mg泼尼松/kg/d),1次/日灌胃;4周时改予中药(10.7.g/kg/d生药药液),1次/日灌胃。3.3肺组织病理切片观察及ELISA法检测肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、TGF-β等炎性因子的表达量。3.4电镜扫描观察各组大鼠照射后14d肺组织细胞内自噬小体的形成情况。3.5运用Western-Blot法检测自噬相关蛋白LC3 II与LC3 I的比值、P62蛋白的表达及AMPK通路蛋白的表达。4研究结果4.1各组大鼠肺组织病理形态学观察照射后4周放血处死大鼠,取出肺组织,HE染色后,空白组大鼠肺泡壁结构完整,平滑肌厚度正常,未见炎性细胞浸润等病理改变;照射组大鼠表现出不同程度的炎性改变,包括肺泡壁增厚,肺泡间隙变窄,炎性细胞浸润渗出明显,毛细血管充血等病理学改变。4.2炎性因子指标检测照射后4周放血处死大鼠,运用支气管肺泡灌洗术进行大鼠全肺灌洗,收集灌洗液,离心取上清,运用ELISA试剂盒进行检测,结果是照射组大鼠IL-6、TNF-α、TGF-β等的表达量均高于空白组,联合用药组在降低炎性因子表达量方面优于单用中药或单用激素组。4.3电镜观察自噬小体形成照射后28d取材,用电镜液固定后,运用电镜扫描观察到各组大鼠肺组织细胞内均有自噬小体的形成,且同一视野下,联合用药组细胞内自噬小体数量多于其他组。4.4自噬相关蛋白及AMPK通路的检测照射后28d取材,运用Western-Blot法检测LC3II与LC3 I的比值、P62蛋白的表达量及AMPK蛋白的表达,结果表明照射组大鼠肺组织细胞内自噬程度收到了一定的抑制,中药清肺益阴方、醋酸泼尼松龙及二者联合用药可以提高自噬程度,并且可以激活AMPK通路,联合用药组效果优于单用中药或单用激素。5研究结论中药清肺益阴方可以减轻放射性肺炎大鼠炎症程度,其起效机制可能是通过激活AMPK通路进而增强大鼠肺组织内细胞自噬的程度而实现的。