论文部分内容阅读
研究背景帕金森病是一种神经系统变性疾病,主要特点是纹状体区的多巴胺能神经元的持续丢失。目前,对帕金森病得主要治疗方法是多巴胺替代治疗。然而,这种替代治疗只是在初期有效,随着疾病的进展,有效性会逐渐下降,并且会产生运动系统的并发症。因此,替换治疗是很必需的。具有自我更新和向其他细胞分化功能的干细胞可能会为帕金森病的治疗提供一种方法。从胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、骨髓间充质干细胞获得多巴胺能神经元有技术和伦理上的限制。而成人外周血来源的多能干细胞(peripheral blood insulin-producing cells, PB-IPC)能克服以上困难。本研究将分离、培养好的PB-IPC移植入帕金森大鼠模型的黑质致密部(SNC)和纹状体(CPU),并对其分化和疗效情况进行初步观察。研究方法1.外周血来源的多能干细胞的制备采集健康志愿者的外周血,加入淋巴细胞分离液分离单个核细胞,加入红细胞分离液分离红细胞。分离出单个核细胞,用无血清培养基培养。2.实时定量PCR采用实时定量PCR检测胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子。使用Qiagenkit提取细胞总RNA,根据Applied Biosystems公司的反转录试剂盒将说明书将总RNA合成为单链cDNA。以ABI Prism7300HT Fast Real-Time PCR System进行实时定量PCR检测,反应体系如下：50℃,2分钟；95℃,2分钟；65℃,60s×40个循环。结果以β-actin作为内参。3.帕金森大鼠模型的制备将6-OHDA定向注射到大鼠的MFB和SNC,并皮下注射阿扑吗啡鉴定帕金森动物模型是否制作成功。4.旋转行为学的测定术后第三周开始观察行为学变化,阿朴吗啡(APO)腹腔注射(0.5mg/kg)。若大鼠恒定转向左侧,且旋转圈数>210r/30min,则视为PD大鼠模型制备成功。移植后分别在2周、4周、6周、8周,观察大鼠旋转行为学的改变。5.免疫荧光染色PB-IPC移植后8周时,每组各取3只大鼠行心脏灌流固定取脑,30%蔗糖脱水后制作20um冰冻切片。每只大鼠取移植位点附近脑组织断面切片2张,0.5%Triton作用15分钟,山羊血清封闭20分钟后,加入TH—抗(1：800)、DAT—抗(1：400),置于湿盒内4℃过夜；第二天PBS洗3次后加入相应荧光二抗。6.ELISA检测以预冷的PBS(0.02mol/L, pH7.0-7.2)充分冲洗待测的组织块,称取组织块的重量。以1：9的比例(即1g组织块：9ml PBS)做成10%的脑组织匀浆,于4℃5000r/min,离心15min,取上清,采用ELISA法测上清液中多巴胺神经递质的含量。研究结果1. PB-IPC表现出类似脐带血多能干细胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形态和生长特点PB-IPC表现出类似脐带血多能干细胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形态和生长特点：圆形或椭圆形,贴壁生长、扩增2. PB-IPC表达胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子PB-IPC表达胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神经元分化的转录因子Ngn1、Ngn2和Mashl;3. PB-IPC移植后,实验组的旋转行为学有明显改善术后第2、4、6、8周计算PB-IPC移植组PD大鼠在阿扑吗啡诱导后30min内的旋转圈数,较术前分别减少了(26±2)%、(34±4)%、(39±7)%和(37±5)%,而对照组无明显改变,各观察点结果同对照组相比均有统计学意义(P<0.05)4.移植入PD大鼠的PB-IPC分化为成熟的多巴胺能神经元移植后8周,可见移植入PD大鼠Brdu阳性的PB-PC(80±3.41)%表达TH,(754±7.07)%表达DAT,对照组PD大鼠的脑组织切片没有Brdu、TH和DAT表达阳性的细胞存在。5.移植的PB-IPC具有释放多巴胺神经递质的功能通过ELISA实验数据分析,移植组上清液中多巴胺含量大约为(1954.12±14.79)pg/g,对照组上清液的多巴胺含量大约为(1687.94±14.82)pg/g。移植组的多巴胺含量明显高于对照组,P<0.05。结论1.PB-IPC表达胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神经元分化的转录因子Ngnl、Ngn2和Mash12. PB-IPC移植入PD大鼠后,能分化为成熟的多巴胺能神经元,能有效治疗PD模型大鼠。