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肺癌发病率呈逐年上升趋势,目前发病率及肿瘤相关疾病致死率均居全国首位,其中约50%的肺癌病例属于肺腺癌。然而因肿瘤异质性等问题,肺癌要做到早发现、早诊断及早治疗较为困难。多数病例确诊时已有转移发生,究其根源还在于肺癌机制研究仍有较多谜团未得到破解。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)理论为肺癌机制研究困局提供了新思路:CSCs因其固有的生物学特性而参与肿瘤的发生发展、侵袭转移、耐受放化疗以及复发等。目前已证实多种恶性肿瘤细胞中存在CSCs,据此我们也推断,在肺癌侵袭转移过程中,CSCs发挥着重要作用。上皮间质转化过程(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)可以强化肿瘤细胞的侵袭转移能力,介导肿瘤转移,与肿瘤发展息息相关。EMT发生时,肿瘤细胞通过上皮表型去分化,转化为间质表型。所以,在我们的研究中将探讨EMT与肺癌干细胞参与肺癌侵袭转移的内在联系。我们将利用流式分选法从人肺腺癌细胞系中分选富集CD90+细胞,经过干性检测推断此细胞亚群具有肺癌干细胞生物学特性,并发现其高侵袭转移能力。为明确CD90+肺腺癌细胞在侵袭转移中的生物学行为,我们结合EMT探讨其相关分子表达差异并探索肺癌标本中CD90表达的临床意义。主要实验方法与研究结果:1、本部分利用流式细胞术、克隆形成实验、Western blot、无血清条件培养成球实验以及裸鼠移植瘤实验等从体内外证实CD90+肺腺癌细胞系具有干细胞生物学特性,并得出如下结果:(1)流式细胞术检测人肺腺癌A549细胞及A549细胞球中特异性表面标志物的表达差异发现,CD90(1.12%±0.23%VS22.43%±0.75%,P<0.05)是较理想的干细胞特异性表面标志物:在亲代细胞中表达量极低,而在富集干细胞的细胞球中表达明显升高。(2)Western blot检测发现,CD90+A549细胞相较于对照组,高表达核心干性相关基因Oct4(0.76±0.045VS0.27±0.022,P<0.05)、Nanog(0.88±0.052VS0.57±0.048,P>0.05);且平面克隆实验(157.33±19.14VS57.33±8.02,P<0.05)及分选后成球实验(68.89%±6.74%VS30.56%±3.47%,P<0.05)表明,CD90+A549细胞具有更强自我更新能力。(3)裸鼠移植瘤实验表明,CD90+A549细胞的体内成瘤能力要明显高于CD90-A549细胞组。2、本部分实验主要探讨CD90+A549细胞在体内外侵袭转移的表现及作用机制,利用RT-PCR、免疫荧光、Western blot、侵袭迁移、肺转移瘤模型构建以及免疫组化等实验手段发现,相较于对照组,具有干细胞特性的CD90+A549细胞亚群具有更强的侵袭迁移能力。主要结果如下:(1)迁移实验及Transwell侵袭实验结果证实:相较于对照组,CD90+A549细胞亚群体外侵袭迁移能力更强(迁移能力(45.67±12.58VS7.83±2.48,P<0.05),侵袭能力(219.12±58.72VS16.43±8.89,P<0.05))。(2)肺转移瘤模型结果提示:CD90+A549细胞亚群体内侵袭转移趋势与体外模型一致,皆要强于对照组,P<0.05。(3)利用RT-PCR、Western blot、免疫荧光实验发现:CD90+A549细胞亚群参与侵袭转移时获得EMT生物学表型,MMP2有可能参与这一过程,并推测转录因子Twist在其中发挥重要作用。(4)CD90在原发灶及转移灶的差异性表达与肺腺癌病理参数具有显著差异,这可能是研究肺腺癌转移机制的重要分子。主要结论:1.分选获得的CD90+A549细胞亚群具有CSCs生物学特性。以特异性表面分子标志物CD90作为分选标志物,可特异性获得CD90+A549细胞亚群,实验检测发现:此群细胞具有更强的自我更新能力、干性相关转录因子高表达、体内成瘤能力更强等干细胞生物学特性。2.CD90+A549细胞亚群具有较高体内外侵袭转移能力。体外迁移实验及Transwell侵袭实验皆提示CD90+A549细胞亚群具有较高侵袭转移潜能;肺内转移瘤模型也提示CD90+A549细胞组成瘤率明显高于对照组,转移细胞形态为典型腺癌细胞。3.CD90+A549细胞亚群获得EMT表型。与对照组相比较,CD90+A549细胞亚群E-cadherin表达下降,N-cadherin、vimentin、MMP2表达均有不同程度上升,同时检测EMT相关转录因子发现,Twist升高明显。4.发现CD90在原发灶及转移灶的差异性表达发现,CD90在转移灶的表达与患者生存时间呈负相关(P<0.05),提示CD90可能是肺腺癌转移机制研究的重要分子。