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随着双光子技术的发展,双光子荧光显微镜在生命科学的研究中已经成为最重要的成像工具。与传统的单光子荧光共聚焦显微镜相比,双光子荧光显微镜具有显著的优势,包括近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等。由于双光子吸收过程与两倍光子能量有关,激发只局限在共焦平面内的极小的区域内。因此近红外的激发光源能透过组织,进行深层成像。用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针,是实现成像的关键。因此,在生命医学领域的成像中,发展高效的双光子荧光探针仍然迫切需要。本文基于ICT机理设计合成了苯乙烯类双光子锌离子比率荧光分子探针BZn和DZn。在BZn和DZn与锌离子作用过程中,锌离子的配位作用减弱了共轭氮原子对荧光团的供电能力,从而引起了吸收和荧光发射波长都蓝移。BZN-Zn的双光子活性吸收截面(Φδ)与传统的TSQ-Zn相比,增大了约18倍。同时BZn在HKE293细胞中实现了锌离子的比率双光子荧光显微成像。探针DZn能够专一识别锌离子,通过肉眼和荧光变化能够很好的区分镉离子。在830 nm处,DZn-Zn的双光子活性吸收截面(Φδ)为185 GM。与TSQ-Zn相比增大40倍。探针DZn是第一个能够区分锌离子与镉离子的双光子锌离子比率荧光探针,能够在120μm深度下,可视化HEK293活细胞和活体组织内源性锌离子的双光子比率荧光成像。设计合成了一个水溶性的铅离子双光子比率荧光分子探针DCN4。随着铅离子浓度的增加,导致在590 nm处出现新的发射峰并逐渐增强。在740 nm处,DCN4-Pb的双光子活性吸收截面(Φδ)为51 GM。探针DCN4是第一个双光子铅离子比率荧光探针。基于疏水作用设计合成了新的双光子蛋白荧光探针DCN2。DCN2与HSA作用后,荧光光谱蓝移73 nm,量子产率增大90倍。荧光强度随着浓度的增加具有良好的线性关系(R=0.999),直到蛋白浓度为20μM(1320μg ml-1)。利用SDS-PAGE凝胶电泳后的HSA与DCN2染色,然后进行扫描成像分析,探针染色的过程仅需要30 min,而且,无论凝胶洗前和洗后的荧光成像都很好。DCN2-HSA的双光子活性吸收截面(Φδ)为85 GM在830 nm。能够利用双光子显微成像能够在180μm深度下,进行实现了HEK293活细胞和活体组织内蛋白双光子荧光显微成像。