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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2),能够引起多种猪病综合征,其中以断奶仔猪多系统综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)造成的危害最为严重,现统称为猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated diseases,PCVAD)。猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的急性传染病,新生仔猪感染后死亡率高,妊娠母猪出现繁殖障碍,猪场一旦发病,很难根除,严重危害猪场的经济效益。衣壳(Capsid,Cap)蛋白是PCV2的主要免疫保护性抗原,能刺激动物机体产生针对PCV2的特异性中和抗体,是研制基因工程疫苗理想的靶抗原。近年来,以PRV为活载体表达外源保护性抗原成为兽医基因工程疫苗的研究热点。为了阐明PRV-JF株的遗传背景,通过对其基因组U_L44(gC)基因进行序列分析,探究PRV-JF株与经典PRV-SC株及近年来流行的PRV变异毒株之间的遗传演化关系。将PRV-JF株与临床病料分离的5株PRV和30个GenBank下载的gC基因序列进行分析表明,这6株PRV与2012年以后流行的毒力增强的变异毒株处于同一分支;这些毒株的氨基酸同源性为98.7%~100%,而与经典的PRV-SC毒株的氨基酸同源性仅为93.2%~94.0%。PRV毒株gC蛋白第52~70位氨基酸为高变区,尤其第64~70位出现7个氨基酸(AAASTPA)插入。尽管PRV-JF株分离于2008年,但它与2011年之后分离的变异毒株属于一个分支,不属于经典毒株,表明PRV变异毒株早在2008年前在我国猪群中就开始流行,以PRV-JF毒株作为重组病毒的亲本有助于PRV变异毒株的防控。为了进一步提高重组病毒株rPRV-JF-TK~-/gE~-/2Cap~+中的Cap蛋白的表达量,选择非必需基因U_S4作为新的插入位点。本试验采用经典的基因同源重组技术构建重组病毒,通过磷酸钙转染方法将pMD-EGFP-LR(gG)与重组病毒株rPRV-JF-TK~-/gE~-/2Cap~+基因组共转染猪肾细胞系(PK-15),经同源重组将U_S4基因替换为EGFP表达盒,经20轮蚀斑克隆纯化、PCR法鉴定,获得重组病毒rPRV-JF-TK~-/g E~-/2Cap~+/gG~-/EGFP~+;以克隆的重组病毒为亲本,将重组转移载体pMD-Cap-LR(gG)与病毒基因组共转染PK-15细胞,反向筛选没有绿色荧光的病毒蚀斑,经6轮蚀斑克隆、PCR法鉴定,最终获得含有3个PCV2-Cap表达盒的3基因缺失重组病毒株(rPRV-JF-TK~-/gE~-/gG~-/3Cap~+)。为了与rPRV-JF-TK~-/g E~-/2Cap~+相鉴别,在U_S4位置表达的PCV2-Cap蛋白C末端插入了flag标签,用PCV2-Cap蛋白特异性单抗与抗flag标签单抗,经IPMA与IFA试验法检测均能够在U_S4位置表达PCV2-Cap-flag蛋白。为了验证rPRV-JF-TK~-/gE~-/g G~-/3Cap~+在动物体内的免疫原性,选用了6~7周龄健康仔猪进行免疫攻毒试验。通过临床症状观察,检测血清中PRV和PCV2抗体水平,对构建的重组病毒表达PCV2-Cap在猪体内的免疫原性进行了评价。用IDEXX PRV gB试剂盒检测到针对PRV-gB抗体,随着时间推移,抗体滴度逐渐增高;然而用IPMA法对PCV2抗体检测结果显示,免疫后28 d未检测出针对PCV2-Cap蛋白的抗体,表明构建的重组病毒株表达的PCV2-Cap蛋白抗原在猪体内没有产生良好的免疫应答。本研究成功地构建了3基因缺失的重组病毒株rPRV-JF-TK~-/gE~-/gG~-/3Cap~+,体外试验证实了该毒株能够表达PCV2-Cap蛋白抗原,利用构建的重组病毒株免疫仔猪后仅能产生针对PRV的抗体应答,未产生针对外源的PCV2-Cap蛋白抗原免疫应答,导致该重组毒株PRV表达PCV2-Cap蛋白的免疫原性不良的原因有待进一步探索。