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第一部分血管性血友病因子裂解蛋白酶的真核稳定表达及其活性检测目的:本研究旨在得到重组的血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13),进一步研究其在血栓止血中的作用。方法:利用脂质体将编码ADAMTS13全长序列的重组质粒p Sec Tag-ADAMTS13转染Hela细胞,用潮霉素(hygromycin-B)筛选得到阳性克隆细胞株,并扩大培养,收集上清。利用Ni-NTA琼脂糖柱,梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,采用GST-His双抗夹心法测定蛋白剪切活性。结果:成功获得一株能恒定分泌重组ADAMTS13蛋白的细胞株ADAMTS2-4,每1 L培养上清可纯化到5.8 mg重组蛋白。Western blotting结果显示,ADAMTS13多抗能与重组蛋白在190 k Da处显单一条带,并且蛋白具有6.4 U/m L的剪切活性(每m L正常人混合血浆中ADAMTS13活性为1U)。结论:重组蛋白具有较好的免疫原活性和酶活性,为进一步研究ADAMTS13作用机理和运用奠定了良好的基础。第二部分2B/2M型VWD的A1区突变联合血小板膜糖蛋白GPIbα影响ADAMTS13水解VWF的功能研究目的:血浆中,血管性血友病因子(VWF)多聚体分子大小由金属蛋白酶ADAMTS13特异性调节。血小板膜糖蛋白(GP)Iα重组片段结合VWF的A1区后可以增强ADAMTS13水解VWF的能力。而2B型和2M型血管性血友病(VWD)分别是由于GPIα与VWF亲和力增强或减弱而引起出血异常的。然而,2B/2M型VWD在A1区的突变与GPIα对ADAMTS13水解VWF的影响仍需作进一步的研究。方法:真核表达了不同类型的全长人重组VWF(r VWF),包括3个2B型突变(P1337L,H1268D,R1308C)、1个2M型突变(D1302G)和野生型(WT)。3种类型的r VWF经多聚体分析、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(RIPA)和VWF辅因子实验(VWF:RCo-ELISA)鉴定。经鉴定后的r VWF在静止或高剪切力条件(GPIα活性片段存在或不存在)被ADAMTS13水解。结果:静止(非变性)或高剪切力条件,相较于野生型2B型突变体表现出对ADAMTS13更高的敏感性,而2M型突变体无明显差别。在静止(变性)或高剪切力(存在GPIα活性片段)条件下,野生型r VWF表现出甚至高过2个2B型突变体对ADAMTS13的敏感性。结论:位于A1区2B型突变通过对VWF自身构象的改变,能增强VWF对ADAMTS13结合从而提高敏感性。当GPIα参与时,野生型r VWF对ADAMTS13的敏感性急剧增加,而一些2B型突变却增加不明显。第三部分ADAMTS13单克隆抗体的鉴定以及生物学功能的研究目的:血浆金属蛋白酶ADAMTS13通过水解VWF调节分子大小,是血小板的聚集和初期止血的关键分子蛋白。ADAMTS13-VWF轴的生理重要性主要体现在遗传或获得性ADAMTS13的缺失相关的血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。制备鼠源性的抗人ADAMTS13的单抗对于研究ADAMTS13的功能至关重要。方法:利用真核表达的重组ADAMTS13截短型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫Balb/c小鼠,经标准单克隆抗体技术制备单抗。用ELISA方法鉴定单抗的特异性,利用免疫印迹技术确定单抗与全长ADAMTS13的识别能力。功能实验方面,观察单抗对ADAMTS13水解VWF的影响。结果:最终获得6株抗ADAMTS13的单抗,克隆号分别为1G11、2F11、6G3、9E1、10A2、10B4。经ELISA鉴定,纯化后的单抗1G11和2F11的效价最高,另外与截短型ADAMTS13-T7蛋白结合能力明显高于全长ADAMTS13蛋白。Western blotting结果显示,6个单抗都能与全长ADAMTS13结合,1G11和2F11条带最亮。另外,在功能实验中,变性条件下,1G11和2F11能够明显抑制ADAMTS13水解VWF,并随着单抗浓度的增加而抑制作用增强。结论:进一步证实了ADAMTS13远端区域确实可能靠近近端有折叠和接触,从而减弱抗体与中心区域的结合。同时也为研究ADAMTS13作用机制提供有力的工具。