“睡美人”“（Sleeping Beauty，SB）转座系统，作为Tc1超家族中的一员，是对斑马鱼基因组进行了分子水平的重建，逐步恢复其ORF、核定位活性、DNA结合活性以及整合活性，并对其进行改造，使之恢复跳跃能力，其采用“剪切—粘贴”的转座机制，属非自主转座系统。它包括两部分:一部分是能从基因组的从一个位置转移到另一个位置的转座子，另一部分是是转座的催化因子，称为转座酶。“睡美人“转座系统是脊椎动物中转座活性最高的转座子，被用作为种系突变和基因传递的工具。　　 人乳铁蛋白(human Lactoferrin，hLF)是转铁家族中约80kDa的铁合蛋白，存在于黏液及大部分体液中，具有广谱抗菌作用。然而由于人乳铁蛋白在初乳中含量最高，产量较少，远远不能满足人类日益增长的生活需求。因此，转基因技术对于生产高质量的人乳铁蛋白具有非常重要的意义。　　 本研究以SB转座系统以β-乳球蛋白为启动子构建乳腺表达载体，在其基础上引入了新霉素基因(Neo)和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为筛选标记，并利用条件培养液培养转基因细胞，试验发现这样可有效缩短G418药物作用时间，为利用体细胞核移植技术(Somatic Cell Nuclear Transfer，SCTN)生产转基因动物提供供体细胞。具体试验内容如下:　　 (1)β-乳球蛋白基因的克隆及其鉴定　　 设计并合成5BLG、3BLG及EGFP的引物，以奶山羊基因组DNA为模板PCR扩增4.2kb的5BLG和1.2kb的3BLG，并以pEGFP-C1为模板扩增了0.8kb的EGFP，并将测序正确的片段先后克隆至pcDNA3.1(-)中完成pcDNA3.1(-)-BLG-EGFP的构建，将纯化的质粒通过脂质体介导法转染至激素诱导培养的奶山羊乳腺上皮细胞（CaprineMammary Epithelial Cells，CMECs）中，结果发现该调控序列可以有效指导报告基因的表达。　　 (2) SB转座子介导的hLF乳腺表达载体的构建及鉴定　　 采用PCR方法从hLF cDNA中扩增出2.1kb的hLF，替换pBLG-EGFP中的EGFP，然后与连接到pT2基础载体对应酶切位点上，构建pT2-BLG-hLF，采用PCR、酶切的方法鉴定载体构建的正确性。脂质体法将pT2-BLG-hLF与SB转座酶共转染至CMECs中，经催乳素、ITS、表皮生长因子及氢化可的松四种激素物质的诱导培养，RT-PCR及Western blot检测表明，本研究构建的表达载体均可在乳腺细胞中表达hLF。此部分试验为下一步制备核移植的转基因供体细胞奠定基础。　　 (3)稳定整合hLF的成纤维细胞株的建立　　 本研究以SB转座系统为基因传递系统，BLG为启动子调控元件，hLF为目的基因，带有双标记基因Neo和EGFP的hLF乳腺特异性表达载体pT2-BLG-hLF-EGFP-Neo，采用脂质体介导法将线性化处理的的无内毒素质粒与SB转座酶共转染至F3代CEFCs中，并用700μg/mL G418筛选10～14d后，得到转基因克隆，挑取单克隆至24孔板中培养，并进行一系列鉴定工作，对阳性克隆扩大培养，从而建立了转hLF基因奶山羊耳成纤维细胞株，为利用核移植技术生产转基因克隆动物所需的供体细胞的制备提供试验依据。