论文部分内容阅读
T7转录系统是原核生物中蛋白高效表达应用最为广泛的系统之一,它由T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)和T7启动子构成。但是T7转录系统在真核生物,特别是作为重要的工业微生物和重要模式系统的酿酒酵母的应用十分有限,原因是缺乏5’帽子结构的T7转录体在酿酒酵母中无法翻译成相应的蛋白质。本研究在酿酒酵母中巧妙的运用了 HIV-1逆转录病毒中重要的调控元件Rev-RRE,在证明该元件能够在酿酒酵母中应用的基础上,利用高效遗传元件和操作工具,不断地构建和优化T7转录系统,最后实现了以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因的蛋白表达。虽然只有一部分酿酒酵母细胞成功表达出EGFP,但表明了 Rev-RRE元件对于跨核膜运输T7转录系统转录产物有一定的促进作用。本课题实验内容共包括以下三部分:1.构建表达T7 RNAP的酿酒酵母菌株BY4741(Ty4::PCYC1-NLS-T7RNAP-TCYC1),同时转入携带 T7 启动子和 EGFP作为报告基因的自主复制型质粒,完成酿酒酵母菌株BY4741(Ty4::PCYC1-NLS-T7RNAP-TCYC1,pUG-PT7-EGFP-TT7)的构建。荧光显微镜观察发现该酵母细胞没有绿色荧光,但通过实时荧光定量PCR结果分析细胞转录出大量的EGFP mRNA。以构建的酿酒酵母菌株INVSC1(pUG-PMet-EGFP-TCYC1)作为对比,酿酒酵母 BY4741(Ty4::PCYC1-NLS-T7RNAP-TCYC1,PUG-PT7-EGFP-TT7)细胞中的EGFPmRNA 含量是 INVSC1(pUG-PMet-EGFP-TCYC1)的 14 倍左右,可见T7 RNAP能够在酿酒酵母中展现了超强的转录能力。2.pESC-Pgal-Rev-EGFP-TCYC1 和 pESC-Pgal-NLS-Rev-EGFP-TCYC1质粒构建成功,并转入酿酒酵母INVSC1中,通过共聚焦显微镜观察Rev蛋白具有核定位功能;然后成功构建表达Rev蛋白的酵母菌株INVSC1(HO::Pgal-Rev-TADH1),同时将EGFP作为报告基因的质粒pUG36,pUG-EGFP-RRE、pUG-Iout-EGFP-RRE、pUG-Iin-EGFP-RRE和甘露糖转移酶Fmi作为报告基因的质粒pUG-Fmi、pUG-Fmi-RRE、pUG-Iout-Fmi-RRE、pUG-Iin-Fmi-RRE分别转入该菌株,通过多功能酶标仪测量平均荧光强度以及采用间苯二酚-盐酸法测量Fmi的酶活,成功验证了该Rev蛋白能在酿酒酵母中结合RRE元件,与酿酒酵母剪切体发生竞争作用;最后通过调控半乳糖浓度调节Rev蛋白表达量,发现Rev-RRE元件对EGFP蛋白的表达调控率在0.55上下波动,即Rev蛋白结合在带有RRE序列的RNA的Rev蛋白分子并达到了饱和。3.利用敲除质粒pSH47完成基因组上整合了 Rev和T7 RNAP蛋白基因的酿酒酵母菌株 BY4741(Ty4::PCYC1-NLS-T7RNAP-TCYC1;HO::Pgal-Rev-TADH1)的构建。将带有RRE序列的T7表达质粒pUG-PT7-EGFP-RRE-TT7 和 pESC-T7RNAP-PT7-Rev-EGFP-RRE-TT7 分别转入该酿酒酵母后,成功将HIV-1 Rev-RRE元件应用于T7转录系统转录产物的跨核膜运输中。共聚焦显微镜观察到部分酿酒酵母细胞能看见绿色荧光,成功表明了 HIV-1 Rev-RRE元件对于T7转录系统转录产物的跨核膜运输具有一定作用。