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磷脂是食用油中胶状物质的主要成分,由于它对食用油的成色、气味及保质期限产生不良影响,故需要在毛油加工过程中通过脱胶工序除去。而传统的脱胶工艺存在高能耗、高污染等问题,因此,越来越多的研究者致力于开发酶法脱胶的新工艺。磷脂酶C (phospholipase C,缩写为PLC, E.C.3.1.4.3)可以将磷脂底物专一性水解为磷酰单酯及甘油二酯,如将其应用于食用油脱胶处理,通过少量水洗即可除去生成的磷酰单酯；而另一转化产物甘油二酯则能够提高毛油保留率。因此,从环保及经济的角度而言,应用PLC脱胶都具有广阔的应用前景。然而,由于该酶来源有限,且价格昂贵,目前尚未实现规模化应用,因此降低PLC的生产成本是工业化应用中亟待解决的问题。考虑到胶质中磷脂类型复杂,且食品生产中安全问题至关重要,本文选择了来源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的PLCBc (PDB编号：2FGN_A)进行研究。该酶具有较广的底物谱,并且是细菌来源中唯一未检测到对哺乳动物有毒性的磷脂酶C。PLC的过量表达可能对细胞生长造成影响,故本论文选择HpaⅡ组成型启动子,该启动子并非严格意义上的启动子,并对表达质粒进行改造,使其更适合外源蛋白的表达；以GRAS (generally recognized as safe)菌株——枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主,通过融合质粒pP43NMK上的信号肽,成功实现了PLCBc的分泌表达。以混合磷脂真实底物进行检测,其酶活为56.14 U/mL发酵液。这是首例报道在枯草芽胞杆菌中实现PLC异源表达,并以真实底物进行检测的研究成果。针对混合磷脂底物,PLC水解产物各不相同,造成检测困难；因此,本工作联合碱性磷酸酶将其进一步水解为磷酸根,构建通过检测磷酸根浓度间接标定PLC活性的高通量筛选策略。选择来源于大肠杆菌K-12的碱性磷酸酶Apase,该酶可专一性水解磷酰单酯,而对二酯和三酯无活性,在枯草芽胞杆菌体内建立了针对混合磷脂真实底物的高通量筛选方法。基于这个筛选方法,采用定向进化策略,经过两轮筛选,共得到三株酶活提高较显著的突变体,序列比对发现,突变体K51E在成熟肽段第8位氨基酸处发生了突变,与野生型相比,其比活约提高23%,推测该位点处氨基酸的突变使蛋白结构发生了微小改变,导致比活提高；突变体T16I/S27T/K51E在信号肽段发生了突变,该组突变导致信号肽分泌能力增强,酶比活没有发生变化,而发酵液总酶活约提高了20%；第三个突变体则在第57位组氨酸处发生了同义突变(CAT/CAC),推测是由于翻译效率提高导致蛋白表达量的提高,故发酵液酶活约提高了20%。本工作中筛选到的突变体,其突变位点均离酶的活性位点较远,该发现对前人在PLCBc蛋白晶体结构及活性位点重要氨基酸功能方面的工作有着重要补充意义,这也正是定向进化相对于理性设计的一大优势；同时,在枯草芽胞杆菌中进行PLC定向进化的工作目前尚未有公开报道,因此,本研究中所搭建的高通量筛选平台,也可以用于改良PLC的其他酶学性质或进行其它相关研究,为推进PLC在食用油脱胶工业的应用奠定了基础。