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细粒棘球蚴病是由细粒棘球蚴寄生于中间宿主人和偶蹄类家畜等,引起肝、脾、肺等组织脏器的压迫性病变,严重危害人民的健康和畜牧业生产。细粒棘球蚴病是我国重点防治的人兽共患病,有368个细粒棘球蚴病流行县,受威胁人数达6000万,居全球首位。2016年对西藏地区调查资料显示阿里地区家畜感染率(28.8 2%)、家庭自宰率(90.6%)、危险因素OR(56.28)均较高,但该地区细粒棘球蚴病基因多态性和种群扩增情况尚不清楚。细粒棘球蚴感染宿主后引起复杂的免疫反应,具体机制不清,也成为细粒棘球蚴病诊断试剂、药物研制的瓶颈。本研究从病原和宿主两个角度开展研究:1.采用PCR法扩增线粒体基因,利用Contig、BLAST、Clustalx1.83等软件对西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株基因多态性进行分析,了解该地区流行的细粒棘球蚴基因型及其单倍型;2.研究细粒棘球蚴感染小鼠外周血中淋巴细胞比例及细胞表面PD-1表达的动态变化和细粒棘球蚴病患者、小鼠血清中Th1和Th2类、促炎和抑炎性细胞因子的表达及,初步探讨中间宿主感染细粒棘球蚴后,宿主淋巴细胞的功能状态。本研究为细粒棘球蚴溯源、病原与中间宿主相互作用机制的研究打下良好的实验基础。一、西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株基因多态性研究目的了解西藏阿里地区细粒棘球蚴的基因多态性及种群扩增情况,为细粒棘球蚴病的溯源提供支持。方法收集阿里地区某医院棘球蚴病患者病灶切除样本,PCR扩增线粒体(细胞色素氧化酶亚单位1基因(cytochrome c oxidase subunit 1,coxl)和细胞色素b基因(cytochrome b,cob)。扩增产物测序后用 Contig 拼接,BLAST、Clusta1x1.83和MEGA7.0等软件进行系统发育分析;利用DnaSP6和NetWork软件分析及制作单倍型网络图;下载全国细粒棘球蚴人体分离株的cox1基因序列,分析并制作单倍型网络图。结果本研究共收集阿里地区79例细粒棘球蚴人体分离株样本,年龄从6-76岁,细粒棘球蚴病患者女性49人,男性30人。根据样本分布阿里地区的细粒棘球蚴病例由高至低依次为:革吉(29)、改则(14)、日土(10)、普兰(9)、措勤(7)、札达(6)、噶尔(4)。西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株基因型有G1、G3、G6和G7四型,其中G3型1例,G6型4例,G7型1例,其余均属于G1型。阿里地区细粒棘球蚴线粒体cob基因检测出8个单倍型,主要的单倍型是Hap-4,单倍型多样性为0.64,核酸多样性 0.0015。cob基因中性检验 Tajima’sD 值为-1.89,P<0.05,Fu’s Fs statistic值为-5.10,P<0.05。阿里地区细粒棘球蚴线粒体cox1基因检测出6个单倍型,主要的单倍型是Hap-1,单倍型多样性为0.36,核酸多样性为0.0012。cox1 基因中性检验 Tajima’sD 值为-1.90,P<0.05,Fu’s Fs statistic 值为-3.53,P<0.05。全国细粒棘球绦虫的cox1线粒体基因检测出40个单倍型,主要的单倍型是Hap-4,单倍型多样性为0.783,核酸多样性为0.040。结论西藏阿里地区人源性细粒棘球蚴基因型和单倍型都很丰富,目前检测出G1、G3、G6、G7四个基因型,以G1型为主,cob和cox1基因单倍型分别是8种和6种,分别以Hap-4和Hap-1为主。中性检验结果显示,阿里地区细粒棘球蚴经历了种群扩增和自然选择的作用。二、细粒棘球蚴感染中间宿主淋巴细胞功能状态的研究目的了解中间宿主感染细粒棘球蚴淋巴细胞的功能状态,为进一步研究细粒棘球蚴与宿主间的相互作用研究奠定基础。方法本研究经腹腔向六周龄BALB/c小鼠注射原头节,建立细粒棘球蚴感染小鼠模型,检测T、B淋巴细胞,CD4+T和CD8+T细胞及其表面抑制性受体PD-1在4、6、8、12和24周的动态变化;通过检测小鼠感染细粒棘球蚴后Th1、Th2类细胞因子、促炎和抑炎性细胞因子在2、3、4、6、8、12和24周动态变化;检测细粒棘球蚴病患者Th1、Th2类细胞因子、促炎和抑炎性细胞因子的表达模式;初步研究细粒棘球蚴感染中间宿主的淋巴细胞功能状态。结果小鼠感染细粒棘球蚴后外周血中,T淋巴细胞在感染后第4周比例显著增高,T淋巴细胞抑制型受体PD-1第6、8周比例显著升高(P<0.05)。B淋巴细胞在感染后第6周比例显著增高,B淋巴细胞抑制型受体PD-1在感染后第6、8、12周显著增高(P<0.05)。小鼠感染细粒棘球蚴后外周血中,CD4+T细胞在感染后第6、8、12、24周比例显著升高,CD4+T细胞抑制型受体PD-1在感染后第6、8、12周比例显著升高(P<0.05)。CD8+T细胞在感染后第6、8周比例显著降低,CD8+T细胞抑制型受体PD-1在感染后第6周显著升高(P<0.05)。小鼠感染细粒棘球蚴后,IL-1β和IL-2水平在第2周显著升高(P<0.05)。IFN-γ、TNF-α、GM-CSF水平在第2、3周显著升高,第4周显著降低(P<0.05)。IL-4水平在第3、12、24周显著升高(P<0.05)。IL-13水平在第24周显著升高(P<0.05)。IL-10水平在第8、12周显著升高(P<0.05)。细粒棘球蚴病人血清中细胞因子IL-17A和IFN-γ水平比未感染的健康对照组显著降低(P<0.05),IL-4和TGF-β水平比未感染的健康对照组显著升高(P<0.05)。结论细粒棘球蚴感染后2-3周,小鼠处于炎症反应期;4-6周启动特异性免疫应答;6-12周,小鼠呈现免疫抑制状态。细粒棘球蚴病患者呈Th2极化和免疫抑制反应。