研究背景和目的:微重力环境下,骨量发生丢失,骨密度下降,骨力学性能降低,呈现出明显的骨质疏松症状。为消除这种影响,通常采用的措施是体育锻炼和药物治疗,但这些措施并不能彻底消除微重力对骨质疏松的影响。随着载人航天技术的发展,会有越来越多的宇航员进入太空,因此,寻找有效的对抗微重力环境下骨质疏松的措施非常有意义。作为骨形成负调控因子,CKIP-1的敲除能够导致骨密度和骨量显著增加。因此,可以尝试采取CKIP-1基因敲除的方法对抗微重力对骨代谢的影响。虽然空间飞行搭载实验可以研究微重力对生物体的作用效应,但其局限性很大。所以,常用尾悬吊动物模型来模拟地面上的微重力。另外,负责骨形成的成骨细胞起源于BMSCs,在微重力环境下,BMSCs怎样定向向成骨分化?它与CKIP-1的敲除能够导致骨量增加有什么联系?因此,我们利用RCCS模拟微重力环境,也对BMSCs的成骨分化进行了研究。本研究利用建立的小鼠尾悬吊模型,将WT小鼠和KO小鼠尾悬吊2w和4w后,比较不同组别小鼠的骨质疏松症状,以期揭示微重力环境下CKIP-1对骨骼成骨化和破骨化平衡的影响,为微重力所致骨质疏松的治疗提供一个新的思路。另外,研究微重力环境下BMSCs的成骨分化,有助于进一步研究CKIP-1敲除对BMSCs成骨化的影响,可以全面揭示微重力环境下骨的重建过程。研究内容与方法:(1)小鼠尾悬吊微重力模型的建立。参考大鼠尾悬吊模型,改进悬吊笼结构,优化悬吊条件,建立小鼠尾悬吊微重力模型。选取2-3月龄C57BL/6J小鼠,雌雄随机,利用医用胶带固定小鼠尾部,系于悬吊笼中进行尾部悬吊。调整高度,保证小鼠后肢离地,躯干与水平的角度约为30°,前肢能够自由活动,能够自由饮水和取食。选用与上述模型组相匹配的WT小鼠,正常条件下饲养,作为对照组。比较不同组别小鼠血清钙离子、ALP和BGP浓度;Micro-CT扫描其股骨,比较骨微结构相关参数的变化;用材料试验机对其股骨进行三点弯曲试验,比较力学相关参数的变化。(2)微重力下CKIP-1敲除对小鼠骨质疏松症状的影响。通过建立的小鼠尾悬吊模型,对WT小鼠和KO小鼠进行了2w和4w的尾悬吊实验。分光光度法和ELISA法检测了不同组别小鼠的血清ALP和BGP浓度变化;Micro-CT扫描其股骨的骨微结构,比较了BV/TV、Tb.Pf、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp等反映骨小梁微观结构的参数;HE染色和免疫组化实验比较其股骨切片形态的差异;三点弯曲试验检测其股骨力学性能的变化,比较了断裂位移、断裂应变、断裂载荷和断裂能量等参数;ELISA法检测其血清成骨标志物PⅠNF和破骨标志物CTX-Ⅰ浓度的差异;RT-PCR和western blot比较其成骨相关基因和蛋白表达水平的差异。(3)微重力对小鼠BMSCs成骨分化的影响。采用密度梯度离心法,提取小鼠原代BMSCs,表面抗原细胞流式术鉴定其纯度。在RCCS中模拟细胞培养微重力环境,加入成骨诱导剂培养14d,研究微重力环境下小鼠BMSCs成骨方向诱导的变化。分光光度法检测其细胞培养上清液ALP浓度的变化,试剂盒比较其细胞ALP染色水平的差异,western blot检测其成骨相关蛋白表达水平的改变。研究结果:(1)建立小鼠尾悬吊模拟微重力模型。与WT小鼠相比,TS小鼠血清中钙离子浓度明显升高、ALP和BGP浓度显著降低;Micro-CT扫描结果证明其股骨的BV/TV下降、Tb.Pf上升、Tb.Th下降、Tb.N减少,而Tb.Sp上升;三点弯曲力学实验也证明其股骨的断裂位移、断裂应变、断裂载荷和断裂能量均发生降低。与WT小鼠相比,TS小鼠无论生化指标、股骨微观结构,还是股骨力学性能,均表现出明显的骨质疏松症状,证明我们所建立的微重力模型是成功的,为后续研究奠定了基础。(2)研究微重力下CKIP-1敲除对小鼠骨质疏松症状的影响。与未悬吊小鼠相比,悬吊组小鼠表现出明显的骨质疏松症状,无论是WT小鼠还是KO小鼠,并且骨质疏松症状随悬吊时间的延长而更加明显,进一步证明我们的实验模型是成功的。具体表现为悬吊组小鼠血清ALP和BGP浓度水平降低;股骨骨小梁显微结构退化,骨微结构更加松散;股骨切片HE染色和BGP免疫组化实验显示其成骨化程度更弱;股骨力学性能下降;血清成骨标志物PⅠNF浓度下降,但破骨标志物CTX-Ⅰ浓度基本保持不变;成骨相关基因和蛋白BMP-2、Col-Ⅰ和Runx2的表达水平显著下降。但在同等尾悬吊处理条件下,KO小鼠比WT小鼠血清ALP和BGP浓度更高;Micro-CT扫描表明其股骨BV/TV升高、Tb.Pf下降、Tb.Th升高、Tb.N升高,而Tb.Sp下降,骨微结构更加致密;股骨切片HE染色和股骨BGP免疫组化实验显示其成骨化程度更强;三点弯曲试验反映其力学性能的相关参数更高,表明其股骨力学性能更好;血清成骨标志物PⅠNF浓度更高,但破骨标志物CTX-Ⅰ浓度相差不明显;成骨相关基因和蛋白BMP-2、Col-Ⅰ和Runx2的表达水平明显增高。以上实验结果表明,在同等处理条件下,与WT小鼠相比,KO小鼠的骨质疏松症状较轻一些,充分证明了CKIP-1敲除对微重力的影响,说明CKIP-1敲除对微重力所导致的骨质疏松症具有一定的对抗作用。同时也证明,CKIP-1只是影响新骨的形成,而对骨骼的吸收几乎没有影响。(3)研究微重力对小鼠BMSCs成骨分化的影响。在成骨诱导液的诱导下,BMSCs向成骨方向分化明显。而在RCCS模拟微重力培养条件下,培养液中ALP浓度降低、BMSCs中ALP染色程度变浅、成骨相关蛋白BMP-2、BGP和Col-Ⅰ的表达程度降低,证明微重力环境下BMSCs成骨化程度降低,微重力可以抑制BMSCs向成骨方向分化,为进一步研究微重力环境下CKIP-1基因敲除和高表达对BMSCs成骨方向分化的影响提供了参考。结论:成功建立小鼠尾悬吊模拟微重力模型。同等尾悬吊条件下,多方面研究发现KO小鼠比WT小鼠表现出较轻的骨质疏松症状,证明CKIP-1敲除可以部分对抗微重力对小鼠骨质疏松的影响,为骨质疏松的治疗提供了一种新的思路。但这种影响只表现在成骨化过程,而对破骨化几乎没有抵消作用。此外,发现微重力可以影响小鼠BMSCs的成骨化,证明微重力的存在抑制了BMSCs向成骨方向的分化,为后续微重力下CKIP-1敲除和高表达对BMSCs成骨分化的研究奠定了基础。