氧化偶氮键[-N=N（-O）-]是一类重要的化学键,被广泛应用于液晶材料、有机染料、生物医药、有机合成中间体等领域。特别值得提出地是,它在高含能材料（high energy density materials）的合成方面具有重要作用,首先它能增加高含能材料的物理密度和能量强度,与此同时又能降低材料的感度,因此能够极大提高高含能材料的轰爆性能以及存运性能。高含能材料的传统化学合成方法面临合成效率低、立体和区域选择性差、经济效益不高、安全性低等诸多问题,因此研究其生物合成,特别是其中关键的氧化偶氮键的生物合成,对此类化合物的工业化生产具有重要意义。目前,已有少数氧化偶氮天然化合物被报道,我们课题组前期从Streptomyces chattanoogensis中分离到了氧化偶氮霉素A、B和C（本文中为化合物5、4和3）三个氧化偶氮天然产物,并且预测了它们的生物合成基因簇和生物合成途径,但是在解析生物合成途径的过程中发现,敲除azo C基因（该基因表达的蛋白为AzoC）,导致突变体积累两个氨基前体。而从氨基前体生物转化形成氧化偶氮键的关键机制,尚未解析清楚,本课题即以此问题为基础展开研究。首先,我们体外重构了AzoC介导的氧化偶氮键的生物合成反应。生物信息学分析显示AzoC属于铁蛋白超家族,与同家族蛋白Aur F和Cml I分别具有37%和53%的相似性;Aur F和Cml I属于非血红素型双铁离子加氧酶,其理论铁酶比例为2:1,我们用菲洛嗪比色法测定了AzoC的铁酶比率,结果显示铁离子和AzoC的比例大约为1.78:1;非血红素型双铁离子加氧酶在溶液中以同源二聚体的形式发挥功能,我们用Native-PAGE和FPLC检测证明AzoC也是以二聚体的形式存在。结合以上数据我们将AzoC归属为非血红素型双铁离子加氧酶。在酶属性鉴定的基础上,我们从azo C基因缺失菌株中分离纯化了化合物1和2（氨基前体）,构建了AzoC的体外酶促反应体系,实现了氧化偶氮霉素的体外酶促合成,在此过程中解析了化合物1和2的C4 E/Z异构对氧化偶氮霉素生物合成过程的影响,并重构了氧化偶氮键的生物合成通路。为了进一步揭示氧化偶氮键的生物合成机制,我们扩展了AzoC的底物谱,发现其还可以催化对氨基苯丙烯酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯乙酸、对氨基苯丙酸和对氨基苯丁酸生成相应的氧化偶氮产物。鉴于对氨基苯丙烯酸（化合物6）与原始底物1结构最为相似,而且没有E/Z异构现象,以其为模式底物进行氧化偶氮键生物合成的分子机制解析,并化学合成了形成氧化偶氮键的可能中间产物,对羟胺苯丙烯酸（化合物7）、对亚硝基苯丙烯酸（化合物8）和产物氧化偶氮苯丙烯酸（化合物9）。以化合物6为模式底物,我们分别利用时序反应和single turn-over实验分析了氧化偶氮键生物合成的反应步骤,时序反应说明羟胺可能是AzoC催化反应的第一个中间产物,而在single turn-over实验中,还原的AzoC仅能催化化合物6转化为化合物8,说明化合物8才是AzoC催化的真正产物。显然地,时序反应与single turn-over实验结果出现了矛盾,为了解决这个问题,我们详细比较了它们的反应体系,发现时序反应体系中存在NADH,而single turn-over体系中没有,我们推测NADH可能以非酶促反应的方式引起化合物8转化为化合物7或化合物9,并通过体外生化实验证明了这个猜测,同时还发现其它氧化还原对NADP⁺/NADPH,FMN/FMNH₂,FAD/FADH₂,H₂O₂/连二亚硫酸钠也可以介导化合物8和化合物7相互转化,并产生化合物9。综合上面分析,我们总结了AzoC催化化合物6形成化合物9的生物合成途径:包含AzoC介导的酶促反应和NAD⁺/NADH介导的非酶促反应。首先AzoC催化化合物6氧化形成化合物8,然后在NAD⁺/NADH介导下,化合物8和化合物7相互转变,并在相互转变的过程中,通过形成氮自由基,产生化合物9（氧化偶氮产物）。另外,我们还利用分子建模和序列突变的方式对AzoC的催化反应机制进行了初步分析。根据文献报道的非血红素型双铁离子加氧酶的理论计算模型分析,此类酶通过形成有活性的加氧中间体（P）来起始反应,亲电氧化氨基形成亚硝基,然后加氧中间体又转换为两性的羟基化过氧化物形态,继而亲核氧化亚硝基形成硝基产物。我们前面的生化研究说明AzoC能催化氨基氧化为亚硝基,与文献计算结果吻合,但是AzoC不能继续催化亚硝基氧化为硝基,我们猜测AzoC-P可能缺失了亲核活性。在经典的非血红素型双铁离子加氧酶Aur F和Cml I中,其过氧中间体（P）亲核氧化亚硝基与蛋白结构中Fe离子附近的E196（196位的谷氨酸）的电子转移相关,因此我们构建了一系列的AzoC突变酶,并初步发现E198-H232序列突变为Aur F中的对应序列可以部分恢复AzoC亲核活性,即能将部分亚硝基氧化为硝基。同时我们还通过蛋白建模和分子对接分析证明了蛋白模型中E198的相对位置可能是AzoC缺失亲核活性的重要原因。最后总结,本课题了氧研究化偶氮键的生物合成机制,它包含AzoC介导的酶促反应和辅酶介导的非酶促反应,此外,我们还通过序列突变和生物信息学模型的方式初步研究了AzoC的酶反应机制。氧化偶氮键生物合成机制的阐明有利于氧化偶氮化合物的生物合成,特别是为氧化偶氮键高含能材料的工业化生物合成提供分子基础。